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副溶血性弧菌(Vibiro parahaemolyticus)是一种常见而重要的食源性致病菌、往往通过污染水产食品造成食用者消化道感染,引起腹泻、呕吐、低烧等症状。鉴于该菌的危害,加强对该菌的监控、深入开展遗传多样性研究显得非常必要,在此基础上研究其危害形成能力的分子机制从而开发新的防控方法和产品更是微生物食品安全研究的发展方向。本论文调查研究了广州地区市售食品中副溶血性弧菌的污染状况;结合广州和深圳两市的食品和临床分离的副溶血性弧菌菌株,开展了珠江三角洲地区副溶血性弧菌遗传多样性研究;克隆表达了副溶血性弧菌群体感应酰基高丝氨酸内酯信号分子合成酶基因vanM,鉴定了副溶血性弧菌酰基高丝氨酸内酯信号分子;探索了酰基高丝氨酸内酯信号分子对直接耐热溶血素基因表达的调控作用;研究了副溶血性弧菌新型群体感应信号分子合成酶基因cqsA的原核表达,鉴定了cqsA相关的群体感应信号分子CAI-1。本论文的主要结论如下: (1)广州地区84市售水产和熟食食品样品中,32份样品中检出了副溶血性弧菌,总检出率38.1%。副溶血性弧菌污染主要发生在水产食品中,检出率为65.1%;熟食食品中也存在副溶血性弧菌食品污染;虾贝类水产食品副溶血性弧菌污染最为严重,19份样品中16份为阳性,其中9份污染量>1100MPN/g;。副溶血性弧菌的食品污染状况环境温度升高而提升;通过调查副溶血性弧菌在广州地区食品中的污染状况收集了135株来源于食品的副溶血性弧菌菌株。 (2)珠江三角洲地区副溶血性弧菌具有丰富的遗传多样:54株副溶血性弧菌的API20E反应可以得出20个反应代码并聚类成6大簇,以Biochem-A为主要生化簇;8种抗生素药敏试验可以发现副溶血性弧菌对萘啶酮酸(NAL)、环丙沙星(CIP)、氯霉素(CHL)均不耐药而对氨苄青霉素(AMP)耐药率最高达到0.88,多重耐药以AMP-ATM为主;检出菌株O抗原血清型有9个,主要型别为O2血清型,共19株,而临床上的流行血清型为O3;ERIC-PCR分型将菌株分为12簇(相似系数以0.80为界),没有明显的优势类群;临床来源菌株毒力基因型别主要为tdh阳性/trh阴性,在食品来源菌株中分别发现2株tdh阳性和2株trh阳性菌株,临床来源菌株未发现trh阳性菌株;食品来源的副溶血性弧菌遗传多样性比临床来源菌株更加丰富。 (3)构建了副溶血性弧菌vanM基因原核表达质粒pET22b-vanM,并在大肠杆菌BL21(DE3)体系中成功诱导表达;利用acyl-HSL分子报告菌株,证明了副溶血性弧菌和BL21(DE3)(pET22b-vanM)具有acyl-HSL信号分子活性;通过薄层层析和HPLC-MS/MS,将副溶血性弧菌和BL21(DE3)(pET22b-vanM)产生的信号分子与acyl-HSL信号分子标准品进行比较分析,首次证实副溶血性弧菌能够产生3-OH-C4-HSL和3-OH-C10-HSL两种acyl-HSL信号分子,而这两种信号分子均由vanM基因负责合成。 (4) C8-HSL和3-O-C10-HSL分子并不影响副溶血性弧菌的正常生长;低浓度甲醇或者乙醇均能促进副溶血性弧菌直接耐热溶血素(TDH)的产生以及编码基因tdh的表达;当甲醇促进tdh表达时,C8-HSL和3-O-C10-HSL分子均能够降低甲醇的促进作用抑制tdh基因表达。推测副溶血性弧菌acyl-HSL群体感应参与副溶血性弧菌的逆境应答。 (5)成功构建了副溶血性弧菌cqsA基因的表达载体pET22b-cqsA;确定了副溶血性弧菌cqsA基因在大肠杆菌BL21(DE3)体系中最优表达条件;发现BL21(DE3)(pET22b-cqsA)不经过IPTG诱导比经过IPTG诱导产生更少的但是活性更强的CqsA蛋白,IPTG诱导产生的CqsA蛋白主要以包涵体形式存在;萃取BL21(DE3)(pET22b-cqsA)发酵液,利用HPLC方法分离纯化了副溶血性弧菌CAI-1信号分子;通过对CAI-1衍生物的LC-MS测试和CAI-1纯化样品的GC-MS测试,首次鉴定副溶血性弧菌CAI-1分子为3-羟基-4-十一烷酮。 本研究丰富我们对副溶血性弧菌遗传多样性的认识,首次鉴定副溶血性弧菌两类别群体感应信号分子。在此基础上,我们将进一步开展这两种副溶血性弧菌群体感应信号通路的功能研究,探索群体感应系统协调副溶血性弧菌在食品和其它环境下生存生长的机制。