论文部分内容阅读
因寒冷造成动物机体产生的冷应激严重制约了我国畜牧养殖业的发展。冷应激下,机体加速能量代谢,以抵抗冷应激所造成的能量缺失。肝脏作为脂质代谢的关键枢纽,参与冷应激下的全身能量供给。O-GlcNAc糖基化修饰是仅由O-GlcNAc糖基转移酶（O-GlcNActransferase,OGT）以及N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（O-GlcNAcase,OGA）一对拮抗酶介导的蛋白翻译后修饰（post-translation modifications,PTMs）。作为机体的“应激感受器”和“营养感受器”,O-GlcNAc糖基化修饰能够对细胞内的信号实现高度动态的调控。那么,O-GlcNAc糖基化修饰是否参与冷诱导下肝脏的脂质代谢。其对肝脏脂质代谢的调控机制又是如何呢?因此,本研究旨在探究冷诱导下O-GlcNAc糖基化修饰在肝脏脂质代谢的作用及其调控机制,为冷诱导下机体肝脏脂质代谢的调控提供一定的参考。本试验首先对肝脏Ogt特异性敲除小鼠（Ogt-LKO,KO）与同窝野生型对照小鼠（Wild Type,WT）进行代谢笼试验,结果发现KO小鼠白天呼吸熵显著低于WT小鼠（P＜0.0001）。脂质消耗会使机体呼吸熵水平下降,表明OGT可能通过肝脏脂质消耗影响能量代谢水平。为进一步确定冷诱导下O-GlcNAc糖基化修饰对肝脏脂质代谢的影响,每天给予小鼠4℃,连续3 h的慢性冷暴露,持续时间为21 d。慢性冷暴露期间检测小鼠采食量及增重,慢性冷暴露结束后采集小鼠血液及肝脏组织;提取血清检测生化相关指标;苏木精-伊红（hematoxylin-eosin staining,HE）、马松（MASSON）、碘酸雪夫（periodic acid schiff,PAS）、油红O染色观察肝组织形态、肝糖原以及脂质含量;Western blot检测O-GlcNAc糖基化修饰,脂质合成以及脂质分解相关蛋白水平;qRT-PCR检测脂质合成及脂质分解基因表达水平。结果显示KO小鼠较WT小鼠相比,摄食及增重显著增加（P＜0.05）。肝功指标谷丙转氨酶（alanine aminotransferase,ALT）（P＜0.0001）、谷草转氨酶（aspartate aminotransferase,AST）（P＜0.001）显著升高。肝脏呈现轻微纤维化。肝糖原含量显著增加（P＜0.0001）,肝组织内脂质沉积显著增加（P＜0.01）。O-GlcNAc糖基化修饰相关蛋白OGT,OGA,O-GlcNAc表达水平显著降低（P＜0.05）,脂质合成相关蛋白脂肪酸合成酶（fatty acid synthase,FASN）,乙酰 CoA 羧化酶 1（acetyl-CoA carboxlyasel,ACC1）,固醇调节元件结合蛋白 1（sterol regulatory element binding protein 1,SREBP1）表达水平显著升高（P＜0.001）,脂质分解相关蛋白肉碱酰转移酶1（carnitine palmitoyltransferasel,CPT1）,酰基辅酶 A 氧化酶 1（acyl-CoA oxidasel,ACOX1）,氧化物酶体增值受体 α（peroxisome proliferator activates receptor α,PPARα）表达水平显著下降（P＜0.001）,说明肝脏Ogt基因特异性敲除促进肝内脂质合成,抑制脂质分解。同时肝脏发生损伤、纤维化;慢性冷暴露下WT小鼠摄食增加（P＜0.001）。肝脏发生空泡样变以及轻微纤维化。肝糖原含量显著减少（P＜0.01）,肝内脂质含量无显著变化。O-GlcNAc糖基化修饰相关蛋白表达水平升高（P＜0.05）,脂质合成相关蛋白,脂质分解相关蛋白及基因表达水平升高（P＜0.05）。KO小鼠慢性冷暴露下摄食和体增重显著增加（P＜0.0001）,AST升高更加明显（P＜0.01）。肝组织损伤以及纤维化程度进一步加重,肝糖原含量（P＜0.0001）,肝组织脂质沉积（P＜0.05）均显著降低。O-GlcNAc糖基化修饰相关蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）。脂质合成相关蛋白及基因表达水平下降（P＜0.05）。脂质分解相关蛋白及基因表达水平升高（P＜0.05）,说明慢性冷暴露加速机体能量需求,冷诱导抑制KO小鼠脂质转运,进一步加重肝脏损伤、纤维化,同时肝脏脂质分解水平随O-GlcNAc糖基化修饰水平的升高而升高;质谱及sWGA结果显示慢性冷暴露下脂质分解关键蛋白ACOX1的O-GlcNAc糖基化修饰升高,说明冷诱导下ACOX1的O-GlcNAc糖基化修饰对肝脏脂质分解进行调控。为进一步探究ACOX1的O-GlcNAc糖基化修饰对脂质分解的调控机制,体外使用AML-12肝细胞构建肝细胞高脂模型,筛选OGT抑制剂四氧嘧啶（Alloxan）最佳作用时间及浓度,细胞分组如下:对照组（NC）、高脂组（PA/OA）以及高脂与Alloxan共同作用组（PA/OA+A）。油红O染色、Western blot及qRT-PCR确定肝细胞O-GlcNAc糖基化修饰和脂质合成及分解的变化水平,结果显示在Alloxan作用下,高脂导致肝细胞内脂质沉积进一步加重,同时脂肪分解相关蛋白及基因表达降低（P＜0.05）,脂质合成相关蛋白及基因无显著变化（P＞0.05）。进一步证实O-GlcNAc糖基化修饰促进肝脏脂质分解。sWGA结果显示抑制细胞OGT的表达能够下调ACOX1的O-GlcNAc的糖基化修饰。免疫荧光以及IP结果显示肝细胞内ACOX1与OGT存在互作;Western blot结果显示高脂条件下ACOX1的泛素化水平降低,且K48位点更加明显,说明OGT与ACOX1互作调控其O-GlcNAc糖基化修饰,抑制ACOX1的蛋白酶体降解,调控肝脏脂质分解。结论:冷诱导下小鼠肝脏脂质分解加快,同时脂质分解蛋白ACOX1的O-GlcNAc糖基化修饰升高抑制ACOX1的K48位点蛋白酶体降解,促进小鼠肝脏脂质分解代谢。