背景:甲状腺癌约占人类所有恶性肿瘤的0.5%-1%,是内分泌系统最常见的肿瘤。甲状腺未分化癌(anaplastic thyroid carcinoma,ATC)是甲状腺滤泡上皮的未分化肿瘤,占所有甲状腺癌的1%-2%。由于ATC具有极强的侵袭性和对治疗的反应差,ATC患者预后较差。因此,需要新的治疗靶点来改善这些患者的预后情况。Kruppel样转录因子家族成员(KLFs)是一种转录调控因子,KLFs与细胞增殖、迁移、凋亡和组织重塑有关。人kruppel样因子5(KLF5)是KLF家族的成员,翻译后可通过磷酸化、乙酰化和泛素化对细胞过程进行调控。研究表明,KLF5在多种人类癌症类型中存在异常表达,并作为促癌基因或抑癌基因发挥作用,从而影响癌症发生和发展过程。Jun激酶(Jun nuclear kinases,简称JNK)信号通路在多种细胞调控中起重要作用,如细胞增殖与分化、细胞凋亡、炎症反应、蛋白质表达等。JNK的失调导致多种疾病,如肿瘤、糖尿病、神经退行性病、免疫性疾病等。JNK1、JNK2和JNK3是JNK通路的调控基因。有研究发现,JNK信号通路可以促进甲状腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移,可能为甲状腺癌的治疗提供新的分子靶点。然而,J-NK信号通路在ATC中的调控作用还尚未知晓。目的:本研究为探讨KLF5对ATC细胞生长及阿霉素敏感性的影响和机制研究,首先利用qRT-PCR检测KLF5在多种ATC细胞中的表达情况,并利用MTT、流式细胞术、Western blot、Transwell和划痕实验检测了敲除KLF5对ATC细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响,初步研究了敲除KLF5对ATC细胞生物学功能的影响;另外,在细胞水平检测了 KLF5过表达和KLF5干扰分别对甲状腺未分化癌细胞HTh74、8505c和对阿霉素耐药的甲状腺未分化癌细胞HTh74Rdox增殖、克隆形成、凋亡的影响,同时检测了 KLF5干扰对阿霉素敏感性的影响,并检测了 JNK信号通路相关分子的表达变化,进一步探究了 KLF5对ATC细胞对阿霉素敏感性的影响及机制;拟体内研究,利用ATC细胞8505c细胞进行构建ATC移植瘤,用阿霉素对荷瘤小鼠进行治疗,并定期检测移植瘤的体积,30天后处死小鼠,检测移植瘤的重量,并利用HE染色和免疫组织化学分别检测KLF5对移植瘤组织形态的影响以及移植瘤中KLF5蛋白的表达情况,并利用Western blot检测了 JNK信号通路相关分子的表达变化,深入探讨了 KLF5对ATC移植瘤生长及阿霉素敏感性的影响和机制。本研究分为三部分:一、KLF5对ATC细胞生物学特性的影响研究;二、KLF5对ATC细胞阿霉素敏感性的影响及机制研究;三、KLF5影响ATC移植瘤生长及对阿霉素敏感性的体内研究。方法:一、KLF5对ATC细胞生物学特性的影响研究1.qRT-PCR检测KLF5在各种ATC细胞系中的表达。2.Western blot 检测 8505c 和 HTh74、HTh74Rdox 细胞中 KLF5 蛋白、增殖相关蛋白Ki67、凋亡相关蛋白cleaved caspase-3、侵袭和迁移相关蛋白MMP-2和MMP-9的表达情况。3.构建KLF5干扰载体:将经过AgeI和EcoRI双酶切的pLenti-hU6-GFP-Puro慢病毒载体与KLF5干扰片段进行连接、转化,对单菌落进行PCR鉴定后,将正确克隆送于上海生工生物工程有限公司进行测序。并对重组慢病毒进行包装和滴定,之后将重组慢病毒感染8505c和HTh74细胞,得到稳定细胞系。4.MTT实验检测8505c、HTh74细胞增殖情况。5.流式细胞术实验检测8505c、HTh74细胞凋亡情况。6.Transwell小室实验检测8505c、HTh74细胞侵袭情况。7.划痕实验检测8505c、HTh74细胞迁移情况。二、KLF5对ATC细胞阿霉素敏感性的影响和机制研究1.构建 KLF5 过表达载体:用 EcoRI 和 NotI 对pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro载体进行双酶切,之后将酶切片段与KLF5基因片段进行连接转化,进行菌落PCR鉴定,并送于上海生工生物工程有限公司进行测序。并对重组慢病毒进行包装和滴定,之后将重组慢病毒感染HTh74和HTh74Rdox细胞,得到稳定细胞系。2.利用 Western blot 检测 HTh74 和 HTh74Rdox 细胞中 KLF5、Ki67、cleaved caspase-3、P-gp、ABCG2以及JNK信号通路相关蛋白p-JNK和JNK的表达情况。3.MTT实验检测HTh74和HTh74Rdox细胞增殖情况。4.克隆形成实验检测HTh74和HTh74Rdox细胞的克隆形成能力。5.MTT检测HTh74和HTh74Rdox细胞对阿霉素的药物敏感性。6.流式细胞术检测HTh74和HTh74Rdox细胞凋亡情况。7.qRT-PCR检测HTh74和HTh74Rdox细胞中MDR1和ABCG2的表达情况。三、KLF5影响ATC移植瘤生长及对阿霉素敏感性的体内研究1.利用8505c细胞进行构建ATC移植瘤,用阿霉素对荷瘤小鼠进行治疗,并定期检测移植瘤的体积,30天后处死小鼠,检测荷瘤小鼠和移植瘤的重量。2.利用HE染色和免疫组织化学分别检测KLF5对移植瘤组织形态的影响以及移植瘤中KLF5蛋白的表达情况。3.利用Western blot检测了 JNK信号通路相关分子的表达变化。结果:一、KLF5对ATC细胞生物学特性的影响研究1.与人类甲状腺滤泡上皮正常细胞Nthy-ori-3-1相比,KLF5在8505c、HTh74和HTh74Rdox细胞中明显过表达,其中在HTh74Rdox细胞中表达水平最高。2.经测序分析显示,KLF5干扰载体构建成功。经测定Lv-shRNA、Lv-sh1-KLF5、Lv-sh2-KLF5 病毒滴定值为 4×108.38、4×108.21、4×107.93TU/mL。在8505c和HTh74细胞中,与对照组相比,sh1-KLF5和sh2-KLF5组KLF5表达明显降低。其中sh1-KLF5组KLF5表达最低,其干扰效率最为明显,因此选择sh1-KLF5组细胞进行后续的功能分析。3.与对照组相比,敲除KLF5后明显抑制8505c和HTh74细胞的增殖,且Ki67表达明显降低。4.与对照组相比,敲除KLF5明显促进8505c和HTh74细胞凋亡,且cleaved caspase-3蛋白表达明显升高。5.与对照组相比,敲除KLF5明显抑制8505c和HTh74细胞的侵袭和迁移,且MMP-2和MMP-9蛋白表达明显降低。二、KLF5对ATC细胞阿霉素敏感性的影响和机制研究1.经测序分析显示,KLF5过表达载体构建成功。经测定Lv-Con、Lv-KLF5病毒滴定值分别为3×108.14、3×107.84 TU/mL。与对照组相比,HTh74细胞中KLF5过表达组KLF5表达明显升高,HTh74Rdox细胞中KLF5敲除组KLF5表达明显降低。2.在HTh74细胞中,与对照组相比,KLF5过表达明显促进HTh74细胞的增殖;在HTh74Rdox细胞中,与对照组相比,KLF5干扰明显抑制HTh74Rdox细胞的增殖。3.HTh74细胞中,与对照组相比,KLF5过表达明显促进HTh74细胞的克隆形成;在HTh74Rdox细胞中,与对照组相比,KLF5干扰明显抑制HTh74Rdox细胞的克隆形成。4.在HTh74细胞中,与对照组相比,KLF5过表达明显促进HTh74细胞中Ki67的表达;在HTh74Rdox细胞中,与对照组相比,KLF5干扰明显抑制HTh74Rdox细胞中Ki67的表达。5.在HTh74细胞中,与对照组相比,随着阿霉素浓度的升高,KLF5过表达明显促进HTh74细胞的活性:在HTh74Rdox细胞中,与对照组相比,随着阿霉素浓度的升高,KLF5干扰明显抑制HTh74Rdox细胞的活性。6.在HTh74细胞中,与对照组相比,加入阿霉素处理后,细胞凋亡明显受到促进,而KLF5过表达明显抑制HTh74细胞的凋亡;在HTh74Rdox细胞中,与对照组相比,加入阿霉素处理和干扰KLF5表达后,细胞凋亡均明显受到促进。7.在HTh74细胞中,与对照组相比,加入阿霉素处理后,cleaved caspase-3的表达明显受到促进,而KLF5过表达明显抑制HTh74细胞中cleaved caspase-3的表达;在HTh74Rdox细胞中,与对照组相比,加入阿霉素处理后,cleaved caspase-3的表达也明显受到促进,而KLF5干扰明显促进HTh74Rdox细胞中cleaved caspase-3 的表达。8.在HTh74细胞中,与对照组相比,KLF5过表达明显促进HTh74细胞中MDR1和ABCG2的表达;在HTh74Rdox细胞中,与对照组相比,KLF5干扰明显抑制HTh74Rdox细胞中MDR1和ABCG2的表达。9.在HTh74细胞中,与对照组相比,KLF5过表达明显促进HTh74细胞中p-JNK蛋白的表达,JNK蛋白表达无明显差异;在HTh74Rdox细胞中,与对照组相比,KLF5干扰明显抑制HTh74Rdox细胞中p-JNK蛋白的表达,JNK蛋白表达无明显差异。三、KLF5影响ATC移植瘤生长及对阿霉素敏感性的体内研究1.与对照组相比,加入阿霉素和敲除KLF5后移植瘤生长明显减慢,体积和体重明显减少;而与阿霉素和敲除KLF5组相比,Dox+KLF5组移植瘤体积和体重又明显减少。2.HE染色发现,与生理盐水组相比,加入阿霉素和敲除KLF5后移植瘤恶性程度减轻,而与阿霉素和敲除KLF5组相比,Dox+sh-KLF5组移植瘤恶性程度减轻最多。3.免疫组化结果显示,与生理盐水组相比,加入阿霉素和敲除KLF5后移植瘤中KLF5阳性表达率明显降低,而与阿霉素治疗组和敲除KLF5组相比,Dox+sh-KLF5组移植瘤中KLF5阳性表达率明显降低。4.与对照组相比,加入阿霉素和敲除KLF5后p-JNK表达明显降低,JNK表达水平无明显变化,而与阿霉素治疗组和敲除KLF5组相比,Dox+sh-KLF5组p-JNK表达又明显降低,JNK表达水平无明显变化。结论:1.细胞水平研究发现,敲除KLF5可以显著抑制8505c和HTh74细胞增殖、侵袭和迁移,并促进细胞凋亡。2.体外研究进一步发现,KLF5过表达能够通过促进HTh74细胞中JNK信号通路的活性,促进细胞增殖和克隆形成,并降低细胞对阿霉素的敏感性,抑制其凋亡;KLF5干扰能够通过抑制HTh74Rdox细胞中JNK信号通路的活性,抑制细胞增殖和克隆形成,并提高细胞对阿霉素的敏感性,促进其凋亡。3.体内研究发现,KLF5敲除能够通过抑制JNK信号通路的活性,提高其对阿霉素的敏感性,进而抑制ATC移植瘤的生长。