结核病是有着高致死率的传染性疾病。随着耐药结核病及结核病/HIV联合感染的出现,使得结核病的形势更加严重。为了应对这种困境,一方面应该针对已知的药物靶点,建立高通量筛选平台,筛选特异性抑制剂,作为候选药物;另一方面应该从结核分枝杆菌中寻找新的靶点,研究它们的功能,为开发新的抗结核药物和新的疫苗提供帮助。结核分枝杆菌dTDP-鼠李糖合成通路是开发抗结核药物的已知靶点,其中dTDP-D-葡萄糖-4,6-脱水酶（RmlB）是参与这条通路的第二个酶。本课题组前期已经证实,编码RmlB蛋白的rmlB基因是分枝杆菌的生长必需基因,缺乏rmlB基因后,分枝杆菌生长受阻。因此,RmlB是可以用于开发新的抗结核药物的潜在靶点。分泌蛋白是结核分枝杆菌与宿主发生相互作用时的重要调节因子,它可以作为干扰治疗的药物靶点,或是毒力因子候选蛋白,亦或是开发疫苗的特异性抗原。结核分枝杆菌Rv1987蛋白是功能未知的分泌蛋白,具有免疫原性,可能参与结核分枝杆菌与宿主的相互作用。基于上述的研究背景,本课题开展了以下两个部分的研究:一、结核分枝杆菌靶酶RmlB筛选平台的建立建立结核分枝杆菌靶酶RmlB酶活性检测平台,为后续以RmlB为靶点高通量筛选抗结核候选药物提供方法。利用此平台研究结核分枝杆菌RmlB的酶促反应动力学以及抑制剂dTTP和dTDP的作用机理,并对海洋放线菌次生代谢物进行高通量筛选。二、结核分枝杆菌假定蛋白Rv1987的功能初探以耻垢分枝杆菌mc2155为模式菌,过表达Rv1987蛋白。一方面研究Rv1987蛋白对分枝杆菌体外生长的影响。另一方面利用重组菌株感染C57BL/6J小鼠,探索Rv1987蛋白在分枝杆菌与宿主相互作用时的免疫调节功能。本文获得以下结果:一、结核分枝杆菌靶酶RmlB筛选平台的建立1.利用pET29b-rmlB/E.coli BL21（DE3）重组菌株表达RmlB蛋白,并通过Ni2+亲和层析法纯化。利用质谱鉴定出纯化的蛋白为结核分枝杆菌RmlB,SDS-PAGE显示出纯化蛋白的纯度良好。2.通过HPLC方法鉴定了 RmlB具有dTDP-D-葡萄糖-4,6-脱水酶活性。3.建立了 RmlB酶活性检测平台,该平台中RmlB酶促反应于96孔板中完成,以产物在320 nm吸收峰的变化量来检测RmlB酶活性。计算出Z’为0.66,说明它可用于高通量筛选结核分枝杆菌RmlB抑制剂。4.利用建立的平台测定了结核分枝杆菌RmlB初速度范围的酶含量是1.8μg,反应时间为15 min,最适pH为7.5,最适温度为30℃,最适离子浓度0.1 mM Mg2+,酶促反应动力学参数Km为0.05 mM、Vmax为0.201±0.03 μmol/min/mg。5.确定了 dTTP和dTDP是结核分枝杆菌RmlB的抑制剂,且抑制类型为竞争性抑制。6.利用建立的筛选平台对海洋次生代谢物进行了高通量筛选,并且获得了两个RmlB候选抑制剂。二、结核分枝杆菌假定蛋白Rv1987的功能初探1.构建了过表达Rv1987蛋白的名为MS1987的重组菌株,并利用Western blot鉴定了 Rv1987蛋白可以在MS1987中能够过表达,且主要表达在沉淀中。2.测定了 MS1987重组菌株在体外正常和酸性条件下的生长曲线,过表达Rv1987蛋白后不影响分枝杆菌的生长,但是会导致细菌抗酸能力下降。3.将MS1987重组菌株以气雾攻击的方式感染了 C57BL/6J小鼠,发现小鼠肺部出现急性炎症反应特征,有中性粒细胞浸润;小鼠血清中IFN-γ、IL-6含量未见升高,但是IL-4和Rv1987特异性IgG抗体均有显著升高;并且肺部的荷菌量明显增加。结论:1.利用纯化的RmlB蛋白,建立了一种基于96孔板上完成反应和检测的RmlB酶活性检测平台,利用此平台测定了结核分枝杆菌RnlB的酶促反应动力学常数以及研究了抑制剂dTTP和dTDP的抑制作用机理,并进行RmlB抑制剂的高通量筛选。2.在体外生长时,过表达Rv1987蛋白后不影响细菌的正常生长但使其抗酸能力减弱;在分枝杆菌与宿主相互作用时,Rv1987蛋白能够诱导小鼠体内的Th2型免疫应答,增强分枝杆菌在小鼠体内的生存能力。未来研究方向:1.继续研究两个RmlB候选抑制剂的抑制作用研究两个候选抑制剂的抑制作用机理及对分枝杆菌全菌体的抑制作用。2.结核分枝杆菌RmlB抑制剂筛选平台的应用利用建立的结核分枝杆菌RmlB抑制剂高通量筛选平台筛选化合物库和天然产物,寻找新的候选药物。3.进一步探索Rv1987蛋白在分枝杆菌与宿主相互作用的作用机制研究Rv1987引起宿主Th2型免疫应答的分子机制及其引发的生物学效应,探索其抗原表位、受体和信号通路。