论文部分内容阅读
作为世界上最古老的酿造酒之一,黄酒具有酿造工艺复杂、风味独特的特点,传承至今已有5000多年的历史。多菌种共酵体系广泛存在于传统发酵食品领域,是黄酒等传统酿造食品生产的核心技术,在保证发酵进程、产生风味物质、形成产品质量等方面发挥了关键作用。由黄酒酿造核心微生物黄酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）HJ和黄曲霉（Aspergillus flavus）SU-16的交互作用形成的独特而高效的双边发酵工艺是黄酒发酵成败的关键,但关于解析发酵过程中两菌相互作用机制的研究仍处于空白阶段,这极大地限制了黄酒酿造工艺和风味品质的提升。因此,本研究以黄酒发酵过程中的核心菌株S.cerevisiae HJ和A.flavu SU-16为研究对象,通过系统生物学手段从功能、转录和代谢三个层面解析了S.cerevisiae HJ和A.flavu SU-16的基因组功能和相互作用机制以及它们在发酵过程中的代谢分工。（1）A.flavus SU-16是一株不产黄曲霉毒素的安全菌株。基于形态学、生理特征、基因型分析以及产黄曲霉毒素能力检测,鉴定确认菌株SU-16是一株不产黄曲霉毒素的安全A.flavus菌株;并利用Nanopore三代测序技术完成了首个酿造用A.flavus SU-16的全基因组测序,SU-16基因组大小37.56 Mb,含有编码蛋白基因12332个,CAZYmes编码基因603个,虽然其中只有一个α-淀粉酶拷贝,但是SU-16具有优异的糖化酶和液化酶活性;次级代谢产物基因簇分析发现SU-16拥有78个次级代谢产物基因簇,其中有9个是SU-16所特有的,21个具有潜在的代谢活性;比较基因组分析结果表明afl J基因的失活,aflT、ver-1、ver A和otm B基因片段以及nor B-cyp A区域启动子和翻译起始位点的缺失,导致SU-16黄曲霉毒素生物合成基因簇失活,因而无法产生黄曲霉毒素以及一些关键中间代谢产物。（2）利用全基因组测序技术和比较基因组学解析了S.cerevisiae HJ基因组功能及结构变异。HJ基因组大小为11.93 Mb,含有蛋白编码基因5238个,转录因子222个;HJ基因组只含有142个编码CAZymes的基因,其中与植物细胞壁降解和淀粉水解相关酶编码基因仅有22个;比较基因组学分析发现HJ基因组有34处发生了由易位或倒位引起的染色重组,有423个与应激反应相关的转录因子（HKR1、MSB2、MSN4和SSK1等）以及与醇类的生成效率（HXT2、HXT9）和芳香醇合成（PHA2）相关的基因在对黄酒生态位的适应性进化中快速进化。（3）A.flavus SU-16在熟麦曲中的代谢物是保证与S.cerevisiae HJ共酵过程中发酵顺利进行的关键因素。基于互作转录组测序和发酵实验的结果表明共酵过程中A.flavus SU-16失去转录活性,其生物量一直处于下降趋势,而在共酵过程中发挥作用的主要是A.flavus SU-16在熟麦曲中的代谢物。在A.flavu SU-16代谢物影响下,S.cerevisiae HJ基因组99%以上的基因都发生了转录表达,且76%以上的基因处于较高表达水平;SU-16代谢物能显著影响涉及S.cerevisiae HJ氨基酸和碳水化合物代谢相关基因的转录表达。在A.flavu SU-16代谢物影响下,多数参与碳水化合物代谢相关的基因表达水平显著上调,A.flavu SU-16代谢物能明显抑制发酵过程中与氨基酸合成相关基因的转录水平,促进氨基酸转运蛋白及多数参与氨基酸分解代谢过程相关基因的表达。A.flavu SU-16代谢物能通过反馈调节抑制Harris途径和莽草酸途经中相关基因的表达水平而降低杂醇的合成效率,同时也能通过调节Ehrlich途径中几个杂醇合成关键基因的转录水平,从而促进了S.cerevisiae HJ对杂醇和醛的合成效率。（4）A.flavus SU-16和S.cerevisiae HJ在共酵过程中分工明确,A.flavus SU-16在麦曲中的代谢物能显著促进共酵过程中风味化合物的形成。共酵过程中SU-16代谢物能调控酵母的生长,促进S.cerevisiae HJ的增殖;熟麦曲中SU-16代谢物会显著影响S.cerevisiae HJ氮代谢,与发酵过程中氨基酸、有机酸、杂醇、醛、酯以及酸等挥发性和非挥发性化合物的生成显著相关,能显著提升共酵过程中的滋味和香气物质含量的同时也会增加影响黄酒感官体验关键化合物的含量。共酵过程中SU-16和HJ分工明确,A.flavus SU-16在制曲过程中除大量分泌酶系等大分子化合物之外,还为发酵过程提供了130种对黄酒风味物质具有潜在影响的化合物,而S.cerevisiae HJ在发酵过程中主要负责161种化合物的合成代谢;A.flavus SU-16菌体在发酵过程中起到的作用较小,而A.flavus SU-16的代谢物在发酵过程中能显著影响S.cerevisiae HJ的代谢,且其大分子代谢物对发酵过程中风味物质形成的影响大于小分子化合物。综上所述,本研究围绕S.cerevisiae HJ和A.flavu SU-16在共酵过程中的相互作用这一主要科学问题,利用系统生物学方法在证明黄酒酿造用核心菌株A.flavus SU-16安全性的同时,也首次获得了世界范围内首个酿造用菌株A.flavus SU-16以及高产β-苯乙醇菌株S.cerevisiae HJ的完整基因组序列,并从基因层面分析了其功能、安全性和基因组结构变异;在此基础上,基于转录组测序和非靶向代谢组学技术证明了发酵过程中A.flavus SU-16代谢物对于黄酒发酵顺利进行的关键作用,及其与S.cerevisiae HJ在共酵过程中的转录互作和代谢分工。本研究结果不仅有助于提升人们对我国传统特色酿造微生物的科学认知,加强对我国传统酿造微生物菌种及其遗传资源的保护和利用,也为共酵过程中关键化合物的调控提供了见解。