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细胞毒T细胞（CTL）和自然杀伤细胞（NK）是体内参加抗肿瘤免疫的主要效应细胞,直接释放细胞毒颗粒是这两种细胞杀伤靶细胞的主要机制。细胞毒颗粒主要由效应分子穿孔素（PFN）、颗粒溶素（GNLY）和颗粒酶组成。CIK细胞（cytokine-induced killer）是将人外周血单个核细胞（PBMC）在体外用多种细胞因子（如抗CD3McAb、IL-2、IFN-γ、IL-1α）诱导培养后获得的一群异质细胞。CIK对肿瘤细胞具有很强的杀伤活性,病人自体细胞诱导后回输CIK辅助治疗肿瘤的方法已经在临床上得到应用。但CIK细胞毒活性增强的分子机理尚不明了。我们测定了健康人和肿瘤患者PBMC以及CIK细胞的抗肿瘤活性,同时也检测了两种细胞中PFN和GNLY蛋白的表达情况,初步分析研究CIK细胞活性增强的分子机理。进行了PFN-N端真核放射诱导表达载体的构建和在肺癌细胞中表达,进一步验证了通过X射线的方法来控制细胞中与癌症相关的外源基因表达的可行性。一、CIK细胞毒活性增强的机理研究1.健康人和肿瘤患者PBMC细胞毒活力及细胞毒效应分子的测定。采集4名健康人和10名恶性肿瘤患者外周血10ml,分离PBMC细胞,一部分用直接荧光标记法分析细胞毒效应分子PFN和GNLY的表达,一部分用LDH释放法进行PBMC细胞对K562的杀伤活性测定。还有部分细胞用于诱导培养形成CIK细胞。2.健康人和肿瘤病人CIK细胞毒活力及细胞毒效应分子的测定。将上述PBMC用诱导培养基培养7～10天获得CIK细胞,同上方法进行CIK细胞内两种蛋白的表达测定及对K562的杀伤活性测定。将诱导后的两组实验结果进行比较,并分别将健康人和肿瘤病人细胞诱导前与诱导后的实验结果进行比较。结果显示,肿瘤病人PBMC对K562细胞的杀伤活力显著低于健康人（P＜0.05）,而且细胞毒效应分子PFN、GNLY表达水平也低于健康人;诱导培养后,肿瘤患者和健康人的CIK对K562的杀伤活力都比PBMC有大幅度的提高,且肿瘤病人为显著提高（P＜0.01）;细胞毒效应分子在二组CIK细胞中的表达量发生分歧:健康人和肿瘤患者CIK细胞GNLY表达量都较PBMC增高,肿瘤患者实验组增高显著（P＜0.01）,但PFN表达都显著降低（P＜0.05）。结果表明,肿瘤病人CIK细胞杀伤活性提高与GNLY基因的表达量升高具有正相关性。而PFN基因表达量却有所降低,这一现象可能与淋巴细胞某种自我反馈调节途径相关。二、人穿孔素N末端肽段的放射诱导表达研究早期生长反应因子1（early growth response-1,Egr-1）基因启动子区含有6个高度保守的CC（A+T）6GG基序（motif）,可在电离辐射产生的氧自由基刺激下诱导下游基因的表达,从而实现对目的基因表达的时空调控。穿孔素（perforin,PFN）在肿瘤免疫中发挥着重要作用,而且第一部分的研究结果证实了,很多肿瘤患者的外周血淋巴细胞中PFN的表达量低于健康人,这与肿瘤的发生发展有着不可忽略的联系。因此,我们拟采用真核表达系统表达PFN生物学活性片段,以期在体外研究PFN片段蛋白对肿瘤细胞的杀伤作用。我们利用上述Egr-1启动子的特性,将人穿孔素氨基端片段连接到Egr-1启动子下游,构建成真核表达载体,对其进行放射诱导表达研究。1.构建人PFN-N肽段的真核放射诱导表达载体。以克隆有hPFN全长cDNA序列的载体pcDNA3.1（+）/hPFN为模板,设计PFN-N基因的上下游引物,用PCR扩增hPFN-N,经Nhe I、Kpn I双酶切后,将该基因片断克隆到含放射诱导启动子的真核表达载体pcDNA3.1（+）/Egr-1中,重组质粒转入大肠杆菌JM109进行阳性克隆筛选,并通过PCR和双酶切法鉴定为所需重组质粒。2.PFN-N端基因在肺癌细胞SPC-Al中的放射诱导表达。在脂质体作用下将重组质粒转染SPC-Al细胞,经过X射线的放射诱导后,应用RT-PCR、细胞免疫化学法检测hPFN-N蛋白的表达,用MTT法测定该蛋白对靶细胞的杀伤活性。结果显示,成功构建了真核放射诱导表达载体pcDNA3.1（+）/Egr-hPFN-N。以重组体转染SPC-Al细胞后,用RT-PCR检测到hPFN-N mRNA的表达。细胞免疫化学法检测结果呈阳性反应,MTT法检测结果为rhPFN-N对靶细胞的杀伤活力为29.2%。本实验成功的构建了PFN-N端的真核放射诱导表达载体,实现了人PFN-N在肺癌细胞中的表达,并证明了该基因的表达可受X射线的时空调控,并且基因产物对靶细胞具有一定的杀伤作用。