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猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV),是引起母猪繁殖障碍和仔猪出现呼吸道疾病的重要病原。该病毒感染后,能够破坏免疫细胞,延迟宿主产生中和抗体和细胞免疫应答,造成免疫抑制,对养猪业危害极大。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF),是一种具有多项潜能的造血生长因子,能够促进树突状细胞分化和成熟,进而增强其抗原递呈能力。为提高我国目前现有高致病性PRRSV弱毒疫苗的免疫效果,本研究在高致病性PRRSV(HP-PRRSV)弱毒疫苗株HuN4-F112感染性分子克隆的基础上,利用融合PCR的方法,将猪源GM-CSF基因序列,引入到弱毒疫苗株HuN4-F112基因组ORF1b和ORF2a之间,最终获得了表达GM-CSF的重组PRRSV,并在体内外进行了重组病毒的生物学特性分析。在试验中,首先构建了重组表达载体pHuN4-F112-GM-CSF;为确保GM-CSF基因在PRRSV中的遗传稳定性,我们在GM-CSF基因后插入PRRSV ORF6的转录调控序列(TRS6),构建了pHuN4-F112-GM-CSF-TRS6全长cDNA克隆；为引入缺失标记基因,在PRRSV的Nsp2的复制非必需区删除了110aa(480-620aa),构建了pHuN4-F112-△110-GM-CSF和pHuN4-F112-△110-GM-CSF-TRS6两个全长cDNA克隆。利用Swa Ⅰ限制性内切酶,分别将上述四株全长cDNA克隆线性化,再通过体外转录获得病毒RNA,用脂质体法将病毒RNA转染BHK-21细胞,在MARC-145细胞中进行病毒拯救、传代和鉴定。对拯救的重组病毒进行CPE观察、RT-PCR扩增、DNA测序、分子标记Mlu Ⅰ酶切鉴定,结果显示：四株重组病毒能够在MARC-145细胞中成功救获,且四株重组病毒在感染MARC-145细胞后,第一代即可引起明显的细胞病变,并将其分别命名为rHuN4-F112-GM-CSF-TRS6、rHuN4-F112-GM-CSF、 rHuN4-F112-△110-GM-CSF-TRS6和rHuN4-F112-△110-GM-CSF。对救获的四株重组病毒,在MARC-145细胞中进行连续传代和鉴定,测序结果显示：含有TRS6的两株重组病毒rHuN4-F112-GM-CSF-TRS6和rHuN4-F112-△110-GM-CSF-TRS6,在连续传代20代过程中,引入的GM-CSF基因均未发生缺失、突变、插入等现象；同时通过间接免疫荧光鉴定,这两株各代次的重组病毒,均能表达GM-CSF,显示良好的遗传稳定性。而不含TRS6的两株重组病毒,其中rHuN4-F112-GM-CSF在传至第3代时出现了GM-CSF基因插入突变现象,而rHuN4-F112-△110-GM-CSF在传至第8代时出现了GM-CSF基因突变现象,对两株稳定遗传的重组病毒rHuN4-F112-GM-CSF-TRS6和rHuN4-F112-△110-GM-CSF-TRS6进行多步生长曲线绘制和噬斑形态分析,结果显示：这两株重组病毒的生物学特性与亲本毒HuN4-F112特性基本一致,表明获得的这两株表达猪源GM-CSF的重组病毒并不影响PRRS病毒的复制,推测在基因组中引入TRS6对外源基因获得稳定遗传和表达具有重要作用。为进一步检验重组病毒rHuN4-F112-GM-CSF-TRS6和rHuN4-F112-△110-GM-CSF-TRS6表达的外源基因GM-CSF对树突状细胞能否发挥成熟和活化作用,我们进行了体外骨髓细胞分化和活化实验。结果显示,这两株重组病毒刺激骨髓源树突状细胞后,树突状细胞表面分子表达水平显著高于亲本毒,说明重组病毒表达的GM-CSF能够刺激树突状细胞进行分化和成熟,而且两株重组病毒之间活化树突状细胞表面分子表达水平没有显著差异。为进一步探明重组病毒对TH1和TH2型细胞免疫反应的影响,我们有针对性的选择了重组病毒rHuN4-F112-GM-CSF-TRS6来作用骨髓细胞,通过qRT-PCR和Multiplex Immunoassays方法,来检测骨髓源树突状细胞分泌相关细胞因子的表达量,结果显示：重组病毒rHuN4-F112-GM-CSF-TRS6刺激树突状细胞分泌的细胞因子,IL-12和IL-1β在24h-96h之间一直呈现高表达状态,且显著高于亲本毒组(p<0.01)；IFN-y和IL-4在96h时也显著高于亲本毒组(p<0.01)。说明重组病毒HuN4-F112-GM-CSF-TRS6作用树突状细胞分化后,不仅能促进树突状细胞表达其特异性细胞因子IL-12,而且能提高IL-1β、IFN-y和IL-4等细胞因子的表达水平,进而对机体THl型和TH2型细胞免疫反应起到促进作用。为进一步研究重组病毒]HuN4-F112-GM-CSF-TRS6在机体内的免疫特性,我们把36头健康仔猪随机分为三组(每组12头),即重组病毒rHuN4-F112-GM-CSF-TRS6免疫组、亲本疫苗毒组和空白对照组,每组分别在免疫后3、7、14、21天时各剖杀3头,采集外周血,分别进行流式细胞术、抗体和病毒载量等检测。结果显示：重组病毒与亲本毒免疫动物后,病毒在试验猪体内病毒载量变化趋势基本相似。在免疫后14天,重组病毒组PRRSV抗体水平显著高于亲本毒组(P<0.05),重组病毒组CD8+T淋巴细胞和CD4+T淋巴细胞的活化比例也显著高于亲本疫苗免疫组(p<0.05)。这初步说明,表达GM-CSF的重组病毒免疫动物后,能够提高机体T细胞的活化水平,增强机体的免疫应答能力。本研究结果为提高PRRSV疫苗的免疫效果和新型疫苗的研制提供了新思路。