研究目的1.尝试制备长循环SPIO (Superparamagnetic Iron Oxide)脂质体,优选出最佳制备方案,并对并对其粒径大小、粒径分布进行表征；透射电镜来测定其形态和大小；2.建立新西兰大白兔反应性增生及VX2转移淋巴结模型,经耳缘静脉注射长循环SPIO脂质体,进一步评估其淋巴组织靶向增强及长循环效果,并与传统SPIO网状内皮阴性对比剂对比,评估两者在MR淋巴成像中对良、恶性淋巴结诊断和鉴别诊断的价值。材料和方法一、长循环SPIO脂质体的制备及表征(一)制备工艺的确定精密称取一定量的Feso4与Fecl3碱性条件下反应后用氨水洗涤,加入1g月桂酸搅拌无沉淀后加热数分钟,于500ml的TES缓冲液透析2天,每隔8小时换液。另取DSPG和DSPE-PEG2000溶于氯仿,于恒温磁力搅拌器内搅拌至澄清后,置于三颈瓶中冲氮气吹干氯仿,成膜后加入20ml TES缓冲液,超声震荡分散后,4℃条件下离心10000转／分,10min,取上清,得到空白脂质体。空白脂质体和吸附月桂酸的SPIO混合后透析3天后,凝胶过柱后置于4℃冰箱备用。(二)空白脂质体及长循环SPIO脂质体粒径及其分布的测定用Malvern-3000HS激光粒度分析仪测定粒径及其分布：吸取5ul制备的相应样品,用双蒸水稀释至量杯中。所选激光光源波长为633.0nm,测试温度为25.00±0.05。(三)空白脂质体、月桂酸稳定的SPIO及长循环SPIO脂质体的形态观察用透射电镜(日立H-600)观察空白脂质体、月桂酸稳定的SPIO及长循环SPIO脂质体大体形态。具体操作方法为：1：4蒸馏水稀释纯净空白脂质体、月桂酸稳定的SPIO及长循环SPIO脂质体液体,取1滴放在镀膜铜网上,滤纸吸去多余液体,加入2%磷钨酸染30s,干燥后电镜下观察。(四)长循环SPIO脂质体铁含量的测定采用临二氮菲法测量长循环SPIO脂质体中铁含量。(五)X射线衍射分析分别取真空干燥的月桂酸稳定的SPIO纳米微粒和长循环SPIO脂质体纳米颗粒研细,置于射线粉末(多晶)衍射仪中。将所得的图谱与国际粉末衍射标准联合会出版的PDF卡片比较,以此来确定样品所具备的晶体结构。二、静脉注射长循环SPIO脂质体及传统SPIO在MR淋巴成像中对照研究(一)实验动物分组健康成年新西兰白兔24只,由空军医院动物实验中心提供,体重2.0-2.5kg,采用随机法分为2组：反应性增生淋巴结组(n=12)、VX2肿瘤转移淋巴结组(n=12)。(二)动物模型建立单侧肌肉注射0.5ml蛋黄乳胶于新西兰白兔后腿,用于建立反应性增生淋巴结模型。从VX2荷瘤种兔取生长活跃的肿瘤组织,研磨成混悬液,抽取0.5ml(浓度大约107／m1)混悬液单侧后腿肌肉接种子新西兰大白兔,用于建立VX2肉瘤淋巴结转移模型。(三)MRI扫描1、平扫：MRI扫描采用头部线圈,扫描序列及参数为：T1WI (TR/TE=539/14ms)横断位及矢状位,T2WI (TR/TE=2234/85ms)横断位及矢状位。2、增强扫描1、反应性增生淋巴结组：采用随机法将反应性增生淋巴结组的新西兰大白兔分成长循环SPIO脂质体增强Ⅰ组(n=6)和SPIO增强Ⅱ组(n=6)。在平扫完毕后,在平扫完毕后,在增强增强Ⅰ组新西兰白兔耳缘静脉注射0.5ml的长循环SPI0脂质体,在增强Ⅱ组注射0.5ml 20umol Fe/ml的SPIO,扫描时间为给药后15分钟、30分钟、60分钟、4小时,24小时、48小时进行扫描,扫描参数同平扫。2.、肿瘤淋巴结转移增生组：将肿瘤转移淋巴结组分为长循环SPIO脂质体增强Ⅰ组(n=6)和SPIO增强Ⅱ组(n=6)。对比剂注射剂量及方式同反应性增生淋巴结组,扫描时间为给药后15分钟、30分钟、60分钟、4小时,24小时、48小时进行扫描,扫描参数同平扫。(四)图像评估1、测量淋巴结大小在T1WI像上,测量各组胭窝后淋巴结的短径,以均数±标准差表示,并与淋巴结病理解剖标本的实测值作对照。2、在不同序列上分别测量平扫、增强后胭窝淋巴结的信号强度,测背景噪声的标准差(Standard deviation of the noise, SDN)。计算各组淋巴结的信噪比(Signal to noise ratio, SNR)(五)病理组织学检查所有实验动物在完成MRI增强扫描后,用静脉过量麻醉法处死动物,仔细暴露胭窝淋巴结,摘除并测量淋巴结的短径,计算淋巴结数目。然后用10-15%中性福尔马林浸泡、固定,常规石蜡包埋,切片后行H-E染色观察淋巴结形态和结构的变化,判别其良恶性。(六)统计学分析应用SPSS13.0软件包,采用两独立样本t检验评价平扫各组不同序列淋巴结的SNR、组间各序列图像上长循环SPIO、SPIO增强后淋巴结SNR是否有显著性差异。P<0.05认为有显著性差异。结果一、空白脂质体、月桂酸稳定的SPIO及长循环SPIO脂质体脂质体的表征1.透射电镜下空白脂质体平均粒径约20nm,月桂酸稳定的SPIO平均粒径约12nm,长循环SPIO脂质体平均粒径约为60nm。2.透射电镜观察空白脂质体呈类圆形、空泡状,大小分布较均匀,表面光滑,粒子间无粘连。月桂酸稳定的SPIO呈类圆形、形态规则、大小均匀的颗粒,可见少许团聚现象。长循环SPIO脂质体呈类圆形,大小均匀,表面平滑完整,粒子之间无粘连,可见壳一核结构。3.X射线衍射分析：月桂酸稳定的SPIO纳米微粒和长循环SPIO脂质体纳米微粒的衍射图说明产物均为面心立方尖晶石结构的Fe304,而且粒子的结晶状态很好。4.用Malvern-3000HS激光粒度分析仪测定的长循环SPIO脂质体测定数据为：强均粒径di=78.7nm；体均粒径dv=76.7nm；数均粒径dn=73.5nm,峰面积：100%,峰数为1；多分散系数(Poly.index)为0.212。5.铁的标准曲线方程：A=0.1947C+0.0008,R2=0.9982。测得长循环SPIO脂质体的铁含量为6.7213mg／ml。二、模型的建立及病理表现1、反应性增生淋巴结和肿瘤转移性淋巴结均制作成功,在T1WI上的SNR均无显著性差异(t=-0.352,P=0.732)及T2WI图像中SNR亦无显著性差异(t=-0.924,P=0.377),平扫两组胭窝淋巴结短径无显著性差异(t=-1.373,P=0.200),但肿瘤转移性淋巴结平均直径大于反应性增生淋巴结。2、各组胭窝淋巴结平扫信号特点在T1WI像上,相对于肌肉及脂肪,各组淋巴结均呈稍高信号,在T2WI像上,各组淋巴结均呈较高信号。3、静脉注射长循环SPIO脂质体及SPIO后各组淋巴结MRI表现(一)反应性增生淋巴结组：耳缘静脉注射长循环SPIO脂质体后,与平扫相比,胭窝淋巴结在T2WI像上信号可见较明显降低,信号降低较均匀。耳缘静脉注射SPIO后,与平扫相比,胭窝淋巴结在T2WI信号降低不明显。(二)肿瘤转移性淋巴结组：耳缘静脉注射长循环SPIO脂质体后,与平扫相比,胭窝淋巴结在T2WI像上,胭窝淋巴结表现为阴性不均匀强化。耳缘静脉注射SPIO后,与平扫相比,胭窝淋巴结在T2WI信号降低不明显。结论1、长循环SPIO脂质体的粒径大小适宜,大体形态呈类圆形,可见壳-核结构。2、静脉注射长循环SPIO脂质体可用来进行MRI淋巴造影。3、传统SPIO由于半衰期短,静脉注射容易被肝脾等网状内皮系统吸收,难以到达淋巴结,强化效果不佳。4、MRI平扫难以准确区分反应性增生淋巴结和肿瘤转移性淋巴结。5、静脉注射长循环SPIO脂质体后,反应性淋巴结强化峰值出现在24h左右。6.静脉注射长循环SPIO脂质体、SPIO后,反应性淋巴结与肿瘤转移性淋巴结表现出不同的强化特征,可以用来鉴别良、恶性淋巴结。