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第一部分:人诱导性多能干细胞的鉴定及其向神经类细胞的分化
目的:
1.检测人诱导性多能干细胞（humaninducedpluripotentstemcells,hiPSCs）的多能性并诱导hiPSCs向神经类细胞分化。
方法：
采用单层贴壁培养法以E8培养基作为增殖培养基进行常规扩增，传代；采用细胞免疫化学（ICC），选取状态好的细胞进行多能性基因标志物OCT-4、Nanog的染色；hiPSCs按2×104/cm2的密度接种到Matrigel胶包被好的培养皿或孔板中，隔天更换成N2/B27基础培养液，在基础培养基中加入LDN193189和SB431542将hiPSCs向神经类细胞进行诱导分化，第6天始撤去SB431542，第8始撤去LDN193189；11天后改用添加了GDNF+BDNF+AA+cAMP的神经类细胞分化培养基，将得到的神经类细胞向神经元方向进行分化至25天。采用免疫细胞化学（ICC）检测神经前体细胞标志物PAX6、Nestin；初级神经元标志物β-tubulinⅢ及多巴胺能神经元标志物TH的表达。
结果：
光镜结果显示：hiPSCs呈克隆样贴壁生长，hiPSCs向神经元诱导分化过程中，细胞形态、排列均有较大变化，诱导第7天克隆消失后呈神经干细胞样极性生长，培养至25天时可以观察到神经元特有的突触样及神经丝样结构。
免疫荧光结果显示：hiPSCs未进行分化时OCT-4、Nanog均阳性；在hiPSCs诱导第7天时细胞分化为PAX6及Nestin阳性的神经干细胞；25天时，细胞能进一步分化为β-tubulinⅢ+的初级神经元细胞，其中可发现TH+的多巴胺能神经元。
结论：
本课题选用的hiPSCs细胞株具有良好的多能性，经神经诱导分化培养后能分化成神经类细胞及初级神经元。
第二部分调控SHH信号通路对hiPSCs向中脑多巴胺能神经元分化的影响
目的：
观察SonicHedgehog（SHH）信号通路激活或抑制对hiPSCs分化方向的影响。
方法：
设3个实验组：（1）LDN193189+SB431542组（LSB组）；（2）SHHC24-II+Purmorphamine组（SHH组）；（3）Cyclopamine组（CYC组）。采用RT-qPCR检测诱导至第7天各组细胞多能性基因OCT-4；背侧前脑标志物PAX6；腹侧底板标志物FOXA2；SHH信号通路关键因子SHH、Ptch-1、Smo、Gli-1；诱导第11天多巴胺能神经前体细胞LMX1A、EN1、MSX1的mRNA表达；诱导第25天的多巴胺能神经元标志物TH的mRNA表达。WesternBlotting检测诱导第7天各组细胞PAX6及FOXA2表达；ICC检测诱导第7天时Nestin、FOXA2、PAX6的表达；分化至第11天检测多巴胺前体细胞标志物LMX1A、EN1的表达；分化至第25天检测β-tubulinⅢ及TH的蛋白表达。
结果
1.RT-qPCR结果显示分化第7天，SHH组及CYC组OCT-4相对表达量明显减少（P＜0.001vsLSB组&P＜0.01vsLSB组），SHH组FOXA2的mRNA表达量相较于LSB组、CYC组明显增高（P＜0.001），PAX6的表达明显减少（P＜0.01）；SHH信号通路相关因子SHH、Ptch-1及Gli-1的表达明显上调（P＜0.01），Smo的表达无明显差异。SHH组多巴胺能神经前体标志物LMX1A及EN1的mRNA表达量较LSB、CYC组明显提高（P＜0.05），MSX1未见明显改变；SHH组多巴胺能神经元标志物TH的mRNA表达量较LSB、CYC组明显提高（P＜0.001）。
2.WesternBloting结果显示分化第7天时，SHH组FOXA2蛋白的表达明显增加，而LSB组及CYC组FOXA2蛋白几乎不表达；SHH组PAX6蛋白表达较LSB组、CYC组明显减少。
3.ICC结果显示第7天时三组细胞大部分可诱导分化为Nestin+的神经干细胞；LSB组、CYC组以PAX6+细胞为主；SHH组以FOXA2+细胞为主；分化第11天，SHH组多巴胺能神经前体标志物LMX1A+及EN1+细胞明显较LSB、CYC组多；分化第25天ICC结果显示SHH组TH+细胞数量较LSB、CYC组明显增加。
结论：
分化早期激活SHH信号可诱导hiPSCs定向分化为FOXA2+的腹侧底板细胞，该类细胞能进一步分化为多巴胺能神经前体细胞及多巴胺能神经元。继续培养至第11天发现多巴胺能神经前体细胞标志物LMX1A及EN1的阳性表达明显增高；提示其能促进人诱导性多能干细胞向中脑多巴胺能神经前体细胞的转化；进一步的定向分化实验结果显示该类细胞能分化为更高比例的TH阳性的多巴胺能神经元。
目的:
1.检测人诱导性多能干细胞（humaninducedpluripotentstemcells,hiPSCs）的多能性并诱导hiPSCs向神经类细胞分化。
方法：
采用单层贴壁培养法以E8培养基作为增殖培养基进行常规扩增，传代；采用细胞免疫化学（ICC），选取状态好的细胞进行多能性基因标志物OCT-4、Nanog的染色；hiPSCs按2×104/cm2的密度接种到Matrigel胶包被好的培养皿或孔板中，隔天更换成N2/B27基础培养液，在基础培养基中加入LDN193189和SB431542将hiPSCs向神经类细胞进行诱导分化，第6天始撤去SB431542，第8始撤去LDN193189；11天后改用添加了GDNF+BDNF+AA+cAMP的神经类细胞分化培养基，将得到的神经类细胞向神经元方向进行分化至25天。采用免疫细胞化学（ICC）检测神经前体细胞标志物PAX6、Nestin；初级神经元标志物β-tubulinⅢ及多巴胺能神经元标志物TH的表达。
结果：
光镜结果显示：hiPSCs呈克隆样贴壁生长，hiPSCs向神经元诱导分化过程中，细胞形态、排列均有较大变化，诱导第7天克隆消失后呈神经干细胞样极性生长，培养至25天时可以观察到神经元特有的突触样及神经丝样结构。
免疫荧光结果显示：hiPSCs未进行分化时OCT-4、Nanog均阳性；在hiPSCs诱导第7天时细胞分化为PAX6及Nestin阳性的神经干细胞；25天时，细胞能进一步分化为β-tubulinⅢ+的初级神经元细胞，其中可发现TH+的多巴胺能神经元。
结论：
本课题选用的hiPSCs细胞株具有良好的多能性，经神经诱导分化培养后能分化成神经类细胞及初级神经元。
第二部分调控SHH信号通路对hiPSCs向中脑多巴胺能神经元分化的影响
目的：
观察SonicHedgehog（SHH）信号通路激活或抑制对hiPSCs分化方向的影响。
方法：
设3个实验组：（1）LDN193189+SB431542组（LSB组）；（2）SHHC24-II+Purmorphamine组（SHH组）；（3）Cyclopamine组（CYC组）。采用RT-qPCR检测诱导至第7天各组细胞多能性基因OCT-4；背侧前脑标志物PAX6；腹侧底板标志物FOXA2；SHH信号通路关键因子SHH、Ptch-1、Smo、Gli-1；诱导第11天多巴胺能神经前体细胞LMX1A、EN1、MSX1的mRNA表达；诱导第25天的多巴胺能神经元标志物TH的mRNA表达。WesternBlotting检测诱导第7天各组细胞PAX6及FOXA2表达；ICC检测诱导第7天时Nestin、FOXA2、PAX6的表达；分化至第11天检测多巴胺前体细胞标志物LMX1A、EN1的表达；分化至第25天检测β-tubulinⅢ及TH的蛋白表达。
结果
1.RT-qPCR结果显示分化第7天，SHH组及CYC组OCT-4相对表达量明显减少（P＜0.001vsLSB组&P＜0.01vsLSB组），SHH组FOXA2的mRNA表达量相较于LSB组、CYC组明显增高（P＜0.001），PAX6的表达明显减少（P＜0.01）；SHH信号通路相关因子SHH、Ptch-1及Gli-1的表达明显上调（P＜0.01），Smo的表达无明显差异。SHH组多巴胺能神经前体标志物LMX1A及EN1的mRNA表达量较LSB、CYC组明显提高（P＜0.05），MSX1未见明显改变；SHH组多巴胺能神经元标志物TH的mRNA表达量较LSB、CYC组明显提高（P＜0.001）。
2.WesternBloting结果显示分化第7天时，SHH组FOXA2蛋白的表达明显增加，而LSB组及CYC组FOXA2蛋白几乎不表达；SHH组PAX6蛋白表达较LSB组、CYC组明显减少。
3.ICC结果显示第7天时三组细胞大部分可诱导分化为Nestin+的神经干细胞；LSB组、CYC组以PAX6+细胞为主；SHH组以FOXA2+细胞为主；分化第11天，SHH组多巴胺能神经前体标志物LMX1A+及EN1+细胞明显较LSB、CYC组多；分化第25天ICC结果显示SHH组TH+细胞数量较LSB、CYC组明显增加。
结论：
分化早期激活SHH信号可诱导hiPSCs定向分化为FOXA2+的腹侧底板细胞，该类细胞能进一步分化为多巴胺能神经前体细胞及多巴胺能神经元。继续培养至第11天发现多巴胺能神经前体细胞标志物LMX1A及EN1的阳性表达明显增高；提示其能促进人诱导性多能干细胞向中脑多巴胺能神经前体细胞的转化；进一步的定向分化实验结果显示该类细胞能分化为更高比例的TH阳性的多巴胺能神经元。