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从家蚕(Bombyxmori)免疫血淋巴中分离出新型抗菌肽moricin后,陆续从myblaeapuera、Heliothisvirescens、Spodopteraexigua,Manducasexta、SPodopteralitura中发现了抗菌肽moricin。其一级结构与天蚕素(Cecropins)类、富含pro残基的多肽类(Proline-richpeptides)、富含gly残基的多肽类(Glycine-richpeptides)、防御素(Defensins)、末端开环多肽类(Open-endcyclicpeptides)没有明显的相似性,成为一种新型的天然抗菌肽模板。
抗菌肽moricin抗菌谱广、抗菌能力强,特别是对&aureus具有强烈的抗菌活性,它对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有强烈的抗菌活性,尤其是对革兰氏阳性菌比家蚕主要抗菌肽天蚕素B。有更高的活性,成为家蚕免疫系统中重要的防御物质。抗菌肽的独特抗菌机理使病原菌不易形成耐药的特性,有可能成为新一代的高效抗菌剂。柞蚕是重要的经济昆虫之一,目前还未见到有关柞蚕moricin的报道。本研究通过采用基因工程技术从柞蚕中筛选分离出抗菌肽moricin基因。柞蚕moricin对柞蚕防御系统的研究具有重要的意义。
根据已知昆虫抗菌肽moricin核苷酸序列和氨基酸序列,分析其保守结构功能域并设计成熟肽的两端引物。首先设计柞蚕moricin基因的简并引物,然后根据得到的目的片段设计特异引物,将特异引物扩增得到的目的片段与表达载体连接,并进行原核表达。
提取免疫柞蚕蛹脂肪体的总RNA,应用RT-PCR,成功得到柞蚕抗菌肽moricin的功能基因,目的片段与T-载体连接并转化DH5a,采用蓝白斑筛选出阳性克隆,经鉴定,成功克隆到柞蚕抗菌肽moricin基因,目的基因的长度为126bp,与家蚕moricin基因长度相同,与家蚕moricinII成熟肽基因的相似性达99.21%;与家蚕moricinII、moricinI的氨基酸序列相似性分别为97.62%、95.24%,与其它昆虫moricin的氨基酸序列相比相似性也很高。
根据得到的柞蚕moricin基因,设计特异引物,并在特异引物的5′-端添加XhoI、NcoI酶切位点,把得到的柞蚕moricin基因与表达载体pET-2ld连接,成功得到重组表达载体。目的基因密码子与表达载体中的组氨酸密码子连接,以融合蛋白的形式进行表达,表达的融合蛋白中含有6-His标签。转化表达宿主菌E.coliRosetta(DE3),诱导表达,产物进行Tricine-SDS-PAGE电泳,结果显示柞蚕moricin基因得到表达,表达的目的蛋白以可溶性的形式存在。融合蛋白经Ni-TNA纯化,目的蛋白进行活性检测,抗菌肽表现出较强的杀菌效果。表明此克隆的moricin基因是可信的,并得到正确的表达,该基因已在Genbank登录,序列号为DQ519400,氨基酸序列也已经登录,序列号为ABF69030。