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目的1.通过氟乙酰胺体内代谢产物氟离子电化学芯片检测方法的研究,建立一种新的快速的检测手段。2.开发便携、简便的氟乙酰胺代谢产物氟离子的芯片检测技术并完成便携式氟离子快速检测仪。3.建立氟乙酸和氟柠檬酸的LC-MS/MS定性、定量方法。4.建立家兔口服氟乙酰胺中毒动物模型。5.研究氟乙酰胺的代谢规律及日常案件中常用检材的前处理方法及分布,为氟乙酰胺中毒案件的检材采取、检测、结果分析、死因判断及法医学鉴定提供科学依据。6.研究氟乙酸和氟柠檬酸在中毒家兔体内分布情况方法1.动物模型将12只家兔随机分为2组,每组6只。第一组为空白对照组,常规饲料喂养,第二组为染毒组,经口灌服致死剂量(10.0mg/kg体重)的氟乙酰胺2.检材采取及处理中毒组在经口服药物后自然死亡,立即解剖取血、尿、心、肝、肾、脑等常用检材,空白组耳缘静脉空气栓塞致死,取同样检材,作为对照。3.F-前处理方法的研究：分析了不同沉淀蛋白、不同pH值条件对氟离子提取回收率的影响,优化了氟离子提取方法。4.氟乙酸和氟柠檬酸LC-MS/MS检测方法条件优化的研究：采用保留时间(Rt)和多反应监测(MRM)方式来对常用检材中氟乙酸和氟柠檬酸进行定性定量分析。5.氟乙酸和氟柠檬酸的提取方法样品制备：生物组织检材样本(如肝、肾等)用匀浆机打碎混匀。取1.0ml血液或1.0g组织检材样品,加入3.0ml水／丙酮(1：4,v／v),超声8分钟,在4000r/min的离心机上离心5分钟除去蛋白质,收集提取液,重复上述提取过程3次,合并3次提取液后,用NaOH调节pH8.0左右,40℃条件下用氮气吹至2.0ml左右水溶液,用3.0ml己烷提取杂质,离心分离后,弃去己烷,用1 mo l/ml的盐酸调节pH小于2.0。用4.0ml乙酸乙酯剧烈震荡5分钟,离心分离,重复提取4次,合并上清液,加入200μL 10%的二乙醇胺丙酮液碱化,在50℃条件下氮气吹干,甲醇定容,过膜待检。6.LC-MS／MS方法检测：采用保留时间和选择2-3对离子定性,以1对响应值相对较高的特征离子的峰面积与其溶液浓度做标准曲线,用外标法进行定量。7.统计学方法：实验数据结果以均数±标准差(X±S)表示,用SPSS11.5统计软件对各检材中氟乙酸和氟柠檬酸的含量进行方差分析。结果1.氟离子选择性芯片在100～10-6mol／L范围内呈线性响应,线性相关系数为0.9994。其平均斜率为58.14,接近理论斜率59.35；氟离子选择性芯片的检测下限为5×10-7mol／L;平均回收率为76.62%(RSD%=1.21%)。2.在10-3～10-6mol／L NaF标准溶液中,氟离子选择性芯片响应时间<2min,在10-6～5×10-7mol／LNaF标准溶液中,氟离子选择性芯片响应时间<5 min。3.用同一芯片在室温下重复连续测定10-3和10-5mol／L标准溶液5次,RSD%分别小于0.43和0.90；用同一芯片在室温下保存5天,每天测定10-3和10-5 mol／L标准溶液1次,RSD%分别小于0.54和1.23。4.芯片pH适用范围pH在5.0～6.0是氟离子敏感膜使用的最佳pH范围。5.KF-.OH-大约为10,也就是说芯片对F-的响应比对OH-的响应灵敏10倍；KF-,Cl-大约为1000,KF-,Br-和KF-，I-大约为1300。6.给药组家兔在给药后1～1.5小时出现强直性痉挛,阵发性抽搐症状,2小时内死亡。染毒组家兔血中氟离子含量较对照组高5-6倍；肝、肾、脑组织中氟离子含量较空白组增高2-4倍,各指标增高显著(P<0.01)。7.LC-MS／MS方法：生物样本中氟乙酰胺的主要代谢产物氟乙酸和氟柠檬酸通过多离子监测(MRM)方式可以得到较好的分离,氟乙酸和氟柠檬酸分别在5.0μg／ml～200.0μg／ml、50.0μg／ml～200.0μg／ml范围呈现良好的线性关系,相关系数R2分别为0.9995、0.9902、最低检测限(LOD)分别为5.0ng、50.0ng。8.从家兔的血液,心,肝和肾中可以检出氟柠檬酸和氟乙酸,胃内容中可以检出氟乙酸,心脏中检出的氟柠檬酸和氟乙酸含量较低,其他个检材与心脏比较呈显著性差异(P<0.01),氟柠檬酸在家兔体内的含量分布为：血>肝>肾>心>胃内容(浓度=0)；氟乙酸的浓度大小依次是：胃内容>肾>肝>血>心。结论1.本课题研究建立的氟乙酰胺代谢产物氟离子检测芯片结合氟离子选择电极对氟离子的高选择性、灵敏性和电位分析技术的简单,便捷等特点,本技术将大大缩短对氟乙酰胺检测的时间,降低检测成本,使检测设备便于携带,实现对氟乙酰胺的现场测定,为取缔剧毒鼠药的销售使用,预防鼠药群体染毒事件的发生提供依据。将采样至实验室的检测路线改为实验室移至现场的服务路线,将为尽快检测出染毒物质、挽救人民生命,为抢救病人赢得时间、节省大量人力物力提供简便、实用的方法。该方法特别适合在基层推广,使大量刑事染毒案件的取证检验工作可以在基层完成检测。2.氟离子检测芯片与其他常见的F-测定方法如离子色谱法、分光光度法等比较,此检测芯片价格低,操作简便,抗干扰能力强,能够快速检测样品中F-含量,可以广泛应用于环境样品、体液、食品中F-含量的检测,是初筛实际样品中F-含量的首选方法。氟离子芯片直接给出样品氟离子浓度,响应速度快,较易实现连续测定与自动监控,有利于发展成为日常检测氟含量的一种方法。3.本文建立了生物检材中氟乙酸和氟柠檬酸HPLC-MS/MS检测方法,回收率高,灵敏度高,重现性好,方法准确、可靠,操作简便,样品不需要衍生化处理,色谱柱寿命长,适用于生物检材中氟乙酰胺代谢产物的快速检测。4.氟乙酰胺中毒的代谢产物氟乙酸和氟柠檬酸广泛存在家兔体内,血液中氟柠檬酸含量最高,氟乙酸胃内容中含量最高。