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目前,喉癌的发生发展受到多种因素的调节,其中紧密连接结构或功能的改变在肿瘤转移浸润中发挥重要作用。而紧密连接蛋白CLDNs表达的改变通过调控相关信号通路进而影响肿瘤的迁移和侵袭。CLDNs羧基末端的PDZ结构域是蛋白质中常见的肽结合结构域之一,该结构域因其在配体选择、与其配体的相互作用模式以及与其他蛋白质相互作用的灵活性而闻名。由于功能的多样性,它可以结合多种类型的信号蛋白,进而调控相关信号通路影响肿瘤的发生发展,比如结合MAPK家族中的JNK蛋白,而JNK信号通路被激活以后作用于其下游靶基因,如MMPs、c-jun、P53等靶基因,尤其是影响相关MMPs的表达和活性,进而影响细胞的增殖、迁移和侵袭。然而关于CLDNs如何通过JNK信号通路作用于其下游MMPs相关靶基因进而影响细胞迁移和侵袭表型的具体机制目前还不清楚。前期工作中我们发现,去甲基化处理可以通过上调CLDN4的表达抑制Hep-2细胞的恶性表型。但CLDN4影响Hep-2细胞迁移侵袭的具体机制尚不明确。有关研究表明部分CLDNs表达改变可以通过影响JNK通路介导相关肿瘤的发生发展。而MMPs是一类非常重要的锌依赖酶家族,它们通过降解ECM、破坏细胞间粘附等各种机制发挥促进肿瘤发生和侵袭的作用。许多CLDNs蛋白可以介导pro-MMP2和pro-MMP9的激活,从而促进肿瘤的侵袭和转移。根据目前有关研究报道发现JNK-MMPs信号通路在不同类型肿瘤的迁移和侵袭中发挥着潜在的作用。但是在喉癌细胞中CLDN4高表达抑制Hep-2细胞迁移和侵袭的作用是否与JNK-MMPs信号通路有关,目前并不清楚。目的:探究JNK-MMPs信号通路在CLDN4表达上调抑制喉癌Hep-2细胞迁移和侵袭中的作用,为将来喉癌的靶向药物治疗提供一定的实验依据。方法:1、免疫组织化学染色技术检测人喉癌组织中CLDN4、P-JNK、MMP2及MMP9的表达。2、RT-PCR及Western-Blot技术检测Hep-2细胞中CLDN4的表达。3、利用携带CLDN4的慢病毒转染Hep-2细胞,得到稳定过表达CLDN4的Hep-2细胞,并通过RT-PCR及Western-Blot技术鉴定慢病毒转染效率。4、细胞划痕和Transwell小室实验检测过表达CLDN4后对细胞迁移和侵袭能力的影响。5、Western-Blot技术检测过表达CLDN4后对细胞中JNK、P-JNK、MMP2及MMP9表达的影响;ELISA技术检测过表达CLDN4后对细胞分泌上清液中MMP2及MMP9表达的影响。6、Western-Blot技术检测AM作用于过表达CLDN4组细胞的最佳作用浓度和时间。7、Western-Blot技术检测AM对细胞中JNK、P-JNK、MMP2及MMP9表达的影响;ELISA技术检测AM对细胞分泌上清液中MMP2及MMP9表达的影响。8、细胞划痕和Transwell小室实验检测AM对过表达CLDN4组细胞迁移和侵袭能力的影响。结果:1、免疫组织化学染色结果显示,与癌旁组织相比,喉癌组织中CLDN4表达明显下调(X~2=14.519,P<0.05),P-JNK、MMP2及MMP9表达均明显上调(X~2=8.571,P<0.05;X~2=6.231,P<0.05;X~2=8.248,P<0.05)。Spearman相关性分析结果显示,在人喉癌组织中CLDN4表达与P-JNK、MMP2及MMP9的表达均成负相关(r_s=-0.259,P<0.05;r_s=-0.241,P<0.05;r_s=-0.260,P<0.05),而P-JNK表达与MMP2及MMP9的表达均成正相关(r_s=0.395,P<0.05;r_s=0.354,P<0.05)。2、RT-PCR及Western-Blot结果显示,与对照组Hela细胞相比,Hep-2细胞中CLDN4在mRNA及蛋白水平上表达均较低(P<0.05)。3、慢病毒转染后获得过表达CLDN4的稳定克隆株;RT-PCR及Western-blot结果显示,与空载组相比,过表达CLDN4组细胞中CLDN4在mRNA及蛋白水平均明显升高(P<0.05)。4、细胞划痕和Transwell小室实验结果显示,与空载组相比,过表达CLDN4组细胞的迁移和侵袭能力明显下降(P<0.05)。5、Western-Blot结果显示,与空载组相比,过表达CLDN4组细胞中P-JNK、MMP2及MMP9的表达均明显下调(P<0.05);ELISA结果显示,与空载组相比,过表达CLDN4组细胞分泌上清液中MMP2及MMP9的表达均明显下调(P<0.05)。6、Western-Blot结果显示,AM的最佳作用浓度为2μM,最佳作用时间为24h(P<0.05)。7、Western-Blot结果显示,AM作用于过表达CLDN4组后,细胞中P-JNK、MMP2及MMP9表达均明显上调(P<0.05);ELISA结果显示,AM作用于过表达CLDN4组后,细胞分泌上清液中MMP2及MMP9表达均明显上调(P<0.05)。8、细胞划痕和Transwell小室实验结果显示,AM作用于过表达CLDN4组细胞后,细胞的迁移和侵袭能力明显增强(P<0.05)。结论:1、喉癌组织中CLDN4低表达,P-JNK、MMP2及MMP9高表达,并且CLDN4表达与P-JNK、MMP2及MMP9的表达具有相关性。2、Hep-2细胞中CLDN4低表达,过表达CLDN4后明显抑制Hep-2细胞的迁移和侵袭能力。3、CLDN4抑制Hep-2细胞迁移和侵袭的作用与JNK-MMPs通路有关。