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第一部分肾透明细胞癌组织及癌旁组织样本队列的构建目的:探索肾透明细胞癌组织及癌旁组织样本队列模型的构建,明确组织性质方法:志愿捐献术后手术标本病例共9人,年龄从47岁至64岁不等。术前均根据影像学检查结果及临床诊断为肾透明细胞癌。9例病患都选择进行肾根治性切除手术方式治疗,其中术前T1aNoM04例(44.4%),T1bNoM05例(55.6%);男性6例(66.7%),女性3例(33.3%);年龄分布为55.2±7.1岁。分别选取9例病例术后切除标本中连续取材肾癌假包膜内组织2枚(0.5cm直径),连续取材假包膜2cm外肾脏组织2枚(0.5cm直径)。对假包膜内、外各1枚组织进行4%甲醛溶液脱水、石蜡包埋固定,并以HE染色、Cytokeratin, pan染色以及Vimentin染色明确细胞学形态以及标志物表达情况;对假包膜内、外各另1枚组织进行快速冰冻处理,后用RNATRIzol试剂盒进行RNA提取。结果:志愿捐献术后手术标本病例共9人,年龄从47岁至64岁不等。术前均根据影像学检查结果及临床诊断为肾透明细胞癌。9例病患都进行肾根治性切除手术方式治疗男性6例(66.7%),女性3例(33.3%);年龄分布为55.2±7.1岁。1)根据术后大体标本及肾门淋巴结病理结果:肾肿瘤分期与术前一致,T1aNoMo4例(44.4%),T1bN0M05例(55.6%)。2)H.E染色分析:从细胞形态学分析,第6例入组病患为肾嫌色细胞癌,其余8例病例均为肾透明细胞癌;肾包膜外肾脏组织无肿瘤组织侵犯,为正常肾脏组织。3)免疫组织化学分析:Vimentin染色提示第6例入组病患标记为阴性,其余8例病例均为阳性;肾包膜外肾脏组织均提示染色阴性。4)抽提RNA质量由电泳明确,RNA提取浓度达到实验要求。结论:样本中出现少发肿瘤并非是我们所能控制的,但术后病理提示的肾细胞癌分期与术前完全一致。快速冰冻法对于肾透明细胞癌组织及假包膜外肾脏组织提取,能够很好的避免RNA降解的问题。第二部分RNA-seq技术检测肾透明细胞癌组织内基因表达水平变化目的:应用RNA-seq技术对肾透明细胞癌组织转录物组进行完全测序,从而从转录物水平验证已知与肾透明细胞癌的相关基因、基因组合或通路;寻找潜在可能的影响肾透明细胞癌细胞增殖、分化以及肿瘤进展的潜在基因组合、通路。方法:自第一部分试验中提取的9例病例的肿瘤组织及瘤旁组织的RNA样本,进行cDNA第一链合成,添加测序接头,按照PCR程序进行40个循环后,应用Illumina HiSeq2000测序。测序后所获得的转录组表达水平数据结合UCSC Genome Browser与MsigDB数据库进行数据归一化处理。而后结合应用Blat(Blast-like alignment tool, Blat)、Bowtie、RUM(RNA-Seq unified mapper, RUM)、DEseq、 GSEA (Gene Set Enrichment Analysis, GSEA)等基因分析软件,在染色体、基因组合、基因通路等多种水平分析RNA-seq所获得的数据,从而对已知的相关基因、基因组合或通路的表达水平进行验证,或发现一些表达水平存在差异的基因组合或通路。结果:根据9例RNA提取样本RNA-seq转录组水平检测的结果,归一化处理后,结合多种基因分析软件,获得以下结果:1)通过应用]RNA-seq技术所进行的全基因组水平的转录组分析,验证肾透明细胞癌已知的异常基因表达如EGLN3、 CA9及VEGFA等,同时第6例肿瘤样本中所独特的基因表达,也与第一部分HE染色及免疫组化的结果一致。2)通过本研究,验证了现有与肾透明细胞癌发病机制相关的VHL/HIF通路,同时在染色体水平上也验证了染色体3p区域的表达缺失与染色体5q区域的表达上调。而第6例样本在染色体1号、2号及17号区域上的表达缺失,在染色体3号与7号区域上的表达上调都提示我们这是肾嫌色细胞癌的特征,与第一部分的观察结果一致。3)本研究更通过对RNA-seq的表达异常基因的集合分析,寻找到35个值得关注的基因组合,验证了与VHL/HIF通路有关的基因组合在肾透明细胞癌组织中的表达差异,以及有关肾功能的基因组合在癌组织中的表达缺失,并且在染色质修饰的相关基因研究中验证了最近有关PBRM1的外显子测序结果。4)通过与NCBI芯片数据库GSE17895与GSE11024中的比对,本研究发现了RUNX1-RUNX1T1通路相关基因在肾透明细胞癌组织中的特异性表达上升。结论:我们应用RNA-seq技术对9对肾细胞癌以及癌旁组织进行了转录组水平的全基因组测序,RNA-seq技术的全数字化信号等技术优势得到充分发挥,有效的验证了现已知的肾透明细胞癌在相关基因、基因组合以及染色体水平上的特异性表达,并且在研究过程中发现了与肾透明细胞癌发病存在相关性的RUNX1-RUNX1T1通路。第三部分RUNX1-RUNX1T1通路的初步验证目的:验证RUNX1-RUNX1T1通路在肾透明细胞癌组织中与癌旁组织中表达水平的差异方法:选取2010年收治于我科的志愿捐献术后手术标本病例共4人,年龄从49岁至58岁不等。术前均根据影像学检查结果及临床诊断为肾透明细胞癌。4例病患都选择进行肾根治性切除手术方式治疗,其中术前T1aN0M03例(75%),T1bNoMo1例(25%);男性3例(75%),女性1例(25%);年龄分布为55.2±7.1岁。分别选取4例病例术后切除标本中连续取材肾癌假包膜内组织2枚(0.5cm直径),连续取材假包膜2cm外肾脏组织2枚(0.5cm直径)。对假包膜内、外各1枚组织进行4%甲醛溶液脱水、石蜡包埋固定,并以HE染色、Cytokeratin, pan染色以及Vimentin染色明确细胞学形态以及标志物表达情况;对假包膜内、外各另1枚组织进行快速冰冻处理,后用RNA TRIzol试剂盒进行RNA提取。选取RUX1-RUNX1T1通路中的NETO2.GBP2及VCAN基因进行qRT-PCR检测。结果:手术标本病例共4人,年龄从49岁至58岁不等。术前均根据影像学检查结果及临床诊断为肾透明细胞癌。4例病患都选择进行肾根治性切除手术方式治疗,其中术前T1aN0M03例(75%),T1bN0M01例(25%);男性3例(75%),女性1例(25%);年龄分布为53.8±3.3岁。1)根据术后大体标本及肾门淋巴结病理结果:肾肿瘤分期与术前一致,T1aNoM03例(75%),T1bNoMol例(25%)。2)H.E染色分析:从细胞形态学分析选取所有4例患者均为肾透明细胞癌。3)免疫组织化学分析:Cytokeratin, pan染色与Vimentin染色提示所有4例肿瘤组织染色均为阳性。4)抽提RNA质量由电泳明确,RNA提取浓度达到实验要求。5)在4例肾透明细胞癌病例的qRT-PCR, NET02、 GBP2及VCAN在四对样本中均表达上调结论:通过RNA-seq技术所获得的有关RUNX1-RUNX1T1通路与肾透明细胞癌发病存在相关性的实验结果是可信的,可以被PCR等多种实验途径验证的。