论文部分内容阅读
研究目的在不影响慢性肝纤维化病程自然发展前提下,分别阻断支配大鼠肝脏的交感神经（sympathetic nerve）、迷走神经（vagus nerve）以降低自主神经系统（autonomic nervous system）的活性,观察自主神经系统对肝卵圆细胞（hepaticoval cell,HOC）活化的调控作用。根据HOC活化细胞数同肝纤维化发展程度病理分级的关系,探讨HOC在慢性肝纤维化病程中所起的确切作用,为以HOC为靶细胞的治疗开拓思路。观察大黄蟅虫丸对慢性肝纤维化大鼠模型HOC的活化作用,了解其在治疗肝纤维化中的科学意义,为中医药治疗肝纤维化提供依据。研究方法1.动物分组:取雄性Wistar大鼠96只,体重180±20g,每组12只,随机分为8组,分别为:HOC活化抑制组（迷走神经肝支切断）,HOC活化增强组（化学性肝交感神经阻断）,肝纤维化模型假手术组,肝纤维化模型组,大黄蟅虫丸高剂量组（按成人5倍剂量）,大黄蟅虫丸中剂量组（按成人2.5倍剂量）,大黄蟅虫丸常规剂量组（按成人等效剂量）,空白对照组。各组给予普通饮食,自由饮水。2.预处理:HOC活化抑制组行迷走神经肝支切断术;HOC活化增强组以6-羟基多巴胺（6-hydroxydopamine,6-OHDA）建立肝脏去交感神经动物模型,具体方法:6-OHDA临用时用灭菌生理盐水配制成100ml/L的溶液。Wistar大鼠10%水合氯醛腹腔注射麻醉,固定于大鼠手术板上,腹部剪毛,局部消毒,于腹部正中纵行切开一长3cm切口,用镊子轻轻夹出小肠,理出空肠段系膜,找到肠系膜血管,用4号半头皮针刺入肠系膜主干静脉中,并同时注入2ml 6-OHDA（含200μg）。用棉签压迫针眼约8～10min,待针孔出血停止,将小肠还纳腹腔,逐层缝合腹壁,常规饲养;肝纤维化模型假手术组则于造模前行腹腔切开,随后手术缝合,术后常规护理。此三组处理均在肝纤维化造模前15天进行以尽量减少对实验结果的影响。3.肝纤维化模型的制作:除空白对照组外,其余各组以二甲基亚硝胺（N-Nitrosodimethylamine,DMN）10mg·kg-1剂量大鼠腹腔注射,每周连续3天,每日1次,共4周。干预方法:大黄蟅虫丸高、中、常规剂量组在造模第一天开始中药干预。大鼠每日灌胃剂量:大黄蟅虫丸高、中、常规剂量组分别含生药3.0g/kg、1.5g/kg、0.6g/kg;其余各组以等量生理盐水灌胃作为对照。4.血清检测:于造模开始后第29日,大鼠以10%水合氯醛（3ml/kg）ip麻醉后,仰卧位固定,打开腹腔,腹主动脉采血,离心获取血清。用放射免疫RIA法检测血清透明质酸（hyaluronic acid,HA）、Ⅲ型前胶原（typeⅢprocollagen,PCⅢ）、层粘连蛋白（Laminin,LN）血清浓度变化。5.肝组织的采集与处理:腹主动脉采血后,脱颈椎处死大鼠。取0.3～0.4cm厚肝组织,40g/L中性甲醛液固定,24h后逐级酒精脱水,二甲苯透明,56℃石蜡包埋,6μm厚切片,用于免疫组化染色。取1.0cm×0.8cm×0.3cm大小肝组织,40g/L中性甲醛液固定,24h后逐级酒精脱水,二甲苯透明,56℃石蜡包埋,4μm厚切片,用于Mallory染色。取50～100mg肝组织放入Trizol中,置入超低温冰箱保存,用于实时荧光定量PCR检测。6.肝纤维化程度鉴定:应用Mallory三步染色法判断各组胶原纤维增生程度。判定标准:0期,正常肝脏,无明显胶原纤维增生;Ⅰ期,胶原纤维增生,中央静脉和门脉区有少量星状胶原纤维束放散,但无间隔形成;Ⅱ期,胶原纤维增生,中央静脉和门脉区结缔组织变厚,由此向四周伸出纤维索,形成不完全间隔;Ⅲ期,胶原纤维大量增生,有个别菲薄的完全间隔形成,或较厚的不完全间隔即将形成假小叶;Ⅳ期,形成的完全间隔较厚,假小叶大量形成。7.卵圆细胞的鉴定与计数:采用免疫组织化学染色,以OV-6作为HOC标志物。免疫组织化学样本制备采用两步法:大鼠肝组织切片脱蜡至水,PBS冲洗、浸泡5分钟,高压热抗原修复,3%H2O2室温室温孵育5～10分钟,加抗大鼠OV-6抗体（1:100稀释）孵育,置入湿盒中,4℃过夜;PBS冲洗,滴加二抗;PBS冲洗,加二氨基联苯胺（diaminobenzidine,DAB）显色5～30分钟。苏木精液复染细胞核1分钟;自来水冲洗,盐酸酒精分色1～2次;自来水泡洗5分钟;切片脱水、透明;中性树胶封片。PBS替代一抗作为空白对照染色。取肝组织免疫组化切片,光镜下（10×10）观察OV-6阳性染色细胞的分布,每张切片随机选择5个不同视野,在40×10放大倍数下,应用IPP6.0软件对阳性细胞染色面积进行统计,以5个不同视野面积计数的平均值为每张切片的计数值。8.统计方法:所有数据处理采用SPSS13.0软件完成,数据均以均数±标准差（（?）±s）表示。HOC活化抑制组、HOC活化增强组、肝纤维化模型假手术组、肝纤维化模型组、空白对照组间HOC细胞计数的比较,大黄蟅虫丸高、中、常规剂量组、肝纤维化组模型组、空白对照组对HOC活化的影响结果以及各组间血清学指标的比较,以及各组TIMP-1 mRNA、CTGF mRNA、Notch1 mRNA的差异表达均采用单向方差分析,组间比较如方差齐采用LSD法,方差不齐则采用Dunnett’s T3法;各组间肝纤维化病理分期的比较采用非参数检验之KruskalWallis检验。HOC增生与肝纤维化的相关分析采用Spearman相关分析法。结果一、自主神经系统及大黄蟅虫丸对肝纤维化病理分期的影响:HOC活化增强组（化学性交感神经阻断）纤维化程度较肝纤维化模型假手术组显著降低;HOC活化抑制组（迷走神经肝支切断）则较肝纤维化模型假手术组纤维化程度加重;肝纤维化模型假手术组与肝纤维化模型纤维化程度无差异。大黄蟅虫丸中剂量组纤维化程度明显低于肝纤维化模型组;大黄蟅虫丸高、常规剂量组纤维化程度低于肝纤维化模型组。二、自主神经系统及大黄蟅虫丸对血清HA的影响:HOC活化抑制组（迷走神经肝支切断）与肝纤维化模型假手术组比较无显著性差异（P=0.142）;与肝纤维化模型假手术组相比,HOC活化增强组（化学性交感神经阻断）HA水平显著降低（P=0.000）。与肝纤维化模型组相比,大黄蟅虫丸高剂量（P=0.003）、中剂量（P=0.000）、常规剂量组（P=0.004）均能显著降低HA水平。三、自主神经系统及大黄蟅虫丸对血清PCⅢ的影响:与肝纤维化模型假手术组相比,HOC活化抑制组（迷走神经肝支切断）PCⅢ水平显著升高（P=0.007）,HOC活化增强组显著（P=0.010）降低。与肝纤维化模型组相比,大黄蟅虫丸高剂量（P=0.040）、大黄蟅虫丸中剂量（P=0.003）可显著降低肝纤维化大鼠模型血清PCⅢ水平。四、自主神经系统及大黄蟅虫丸对血清LN的影响:与肝纤维化模型假手术组相比,HOC活化抑制组（迷走神经肝支切断）无显著性差异（P=0.148）;HOC活化增强组（化学性交感神经阻断）LN水平显著降低（P=0.001）。与肝纤维化模型组相比,大黄蟅虫丸中剂量（P=0.001）、常规剂量（P=0.048）可显著降低肝纤维化大鼠模型血清LN水平,大黄蟅虫丸高剂量组（P=0.146）差异无统计学意义。五、自主神经系统及大黄蟅虫丸对肝纤维化模型大鼠HOC增殖的影响:与肝纤维化模型假手术组相比,HOC活化抑制组（迷走神经肝支切断）、HOC活化增强组（化学性交感神经阻断）均有显著性差异（P=0.000）,HOC活化抑制与HOC活化增强分别能抑制、促进HOC的增生。与肝纤维化模型组相比,大黄蟅虫丸高、中、常规剂量组均可显著降低DMN肝纤维化大鼠模型HOC增殖（P<0.05）。六、HOC活化增殖与肝纤维分级的相关性分析1.自主神经系统对HOC活化增殖与肝纤维化分级相关性分析将HOC活化抑制组（迷走神经肝支切断）、HOC活化增强组（化学性交感神经阻断）、肝纤维化模型假手术组纳入统计范围。结果显示:rp＝-0.776,P＝0.000,两者存在显著负相关关系。即随着HOC数量的增多,纤维化程度呈下降趋势。2.大黄蟅虫丸对HOC活化增殖与肝纤维化分级相关性分析将大黄蟅虫丸高、中、常规剂量组、肝纤维化模型组纳入统计范围。结果显示:rp＝0.602,P＝0.002,两者存在显著正相关关系。即HOC活化数量越少,肝纤维化程度越低。七、自主神经系统及大黄蟅虫丸对肝纤维化模型大鼠TIMP-1 mRNA、CTGFmRNA、Notch1 mRNA表达的影响:与肝纤维化模型假手术组相比,HOC活化抑制组（迷走神经肝支切断）、HOC活化增强组（化学性交感神经阻断）TIMP-1m RNA、CTGF mRNA、Notch1 mRNA的表达均显著下调。与肝纤维化模型组相比,大黄蟅虫丸各剂量组TIMP-1m RNA、CTGF mRNA、Notch1 mRNA的表达均显著下调（P＜0.01）。结论一、交感神经系统（sympathetic nervous system,SNS）抑制剂（SNSIs）可以显著降低DMN肝纤维化大鼠纤维化程度,保护实验动物肝损伤;迷走神经阻断则加重DMN大鼠纤维化、损伤程度。二、SNSIs通过SNS对肝星状细胞（hepatic stellate cell,HSC）和HOC的直接调节影响对损伤肝脏的修复;推测大鼠的肝脏祖细胞可能表达M3型受体,迷走神经肝支通过乙酰胆碱（ACh）结合M3型受体刺激了卵圆细胞的激活。三、大黄蟅虫丸抗纤维化机制之一是抑制了TIMP-1的活性,降低了与MMPs的结合,使MMPs对ECM的降解作用增强;大黄蟅虫丸可以抑制HSC的增殖,促进MMPs对ECM的降解,体现了其“化瘀”的作用。四、大黄蟅虫丸抗纤维化的机制与下调纤维化病程中过度表达的CTGFmRNA有关。CTGF被抑制,其促ECM合成的作用减弱,有利于ECM降解,是“化瘀”的另一种体现;其表达细胞黏附因子的作用减弱,使细胞不易黏附和结合基质蛋白,脱离纤维趋化环境,此即中医“活血”思想的体现。五、大黄蟅虫丸通过下调Notch1 mRNA的表达诱导HOC向肝细胞方向分化。六、在慢性肝维化病理状态下,HOC的激活是一种机体自身适应性反应,便于肝脏的修复;但长期地处于这种状态,HOC的过度活跃、增生导致肝脏结构、功能破坏和肝癌的发生。