创伤、感染、肿瘤切除和发育异常等疾病导致的骨缺损发病率很高，严重影响患者的生活质量，是临床治疗的难题。目前，人们多采用新鲜自体骨移植治疗，但由于骨来源的限制及治疗相关并发症等问题，限制了该方法的广泛应用。因此，研究新的治疗策略已十分必要。最近，组织工程技术的发展为治疗大段骨缺损提出了新的思路，即将活细胞体外培养扩增后接种于某些特殊支架材料上，以构建生物人工组织，植入受体后在局部微环境的作用下发挥细胞的成骨效应。支架材料为细胞提供机械支持、迁徙通路、血管植入环境和黏附表面，而细胞固有的生物学信号促使其增殖分化成熟。然而，种子细胞的来源及其生物学特性、支架材料的组成、材料与细胞的复合方法以及植入细胞的体内功能变化等，都是悬而未决的问题。组织工程的核心是建立由细胞和生物材料构成的三维空间复合体。理想的骨种子细胞应具有以下几个特点：取材容易，在体内外具有较强的传代能力，同时保持其成骨分化能力；在体外培养中易定向分化为成骨细胞，植入机体后能适应受区生理、病理、应力等生物学环境改变并保持成骨活性。骨髓来源的间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)符合上述标准，它不仅具有良好的成骨细胞分化潜能，还易于外源基因的导入和表达，因此，有可能作为种子细胞在组织工程领域中得到广泛的应用。本研究采用兔大段骨缺损动物模型，探讨骨髓MSCs作为种子细胞在骨组织工程领域中的应用。参考人骨髓MSCs分离培养方法，我们将兔骨髓细胞经过密度为1． 073g／ml的Percoll分离液分离骨髓单个核细胞，用含10％筛选血清的低糖DMEM进行培养。随后的实验结果证明，用这种方法分离的MSCs的形态与人骨髓MSCs相似，呈纺锤型贴壁生长；体外培养细胞倍增时间为20小时左右，说明其增殖较快；组织化学染色结果显示，所分离的兔MSCs细胞化学特征为糖原强阳性(PAS)，部分细胞碱性磷酸酶(ALP)阳性(阳性率约5％)，苏丹黑阴性(SB)，酸性醋酸酯酶(ANAE)弱阳性，非特异性脂酶(NSE)阴性；细胞周期分析表明，G0／G1、 S和G2M所占比摘要，3-例分别为84.56%，3.26%和12.18%。结果提示体外培养的MSCS具有典型的干细胞增殖特点，即只有少数细胞处于活跃的增殖期，大部分的细胞处于静息期。对所获MSCS的功能研究结果显示，兔骨髓MSC具有多向分化能力，即体外可以诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞。MSCS成骨细胞诱导分化过程中，6~8天以后细胞形态开始变化，碱性磷酸酶活性开始上调。随着诱导时间的增长，细胞形态逐渐变为多角样，碱性磷酸酶活性逐渐增强。异位成骨实验表明，MSCS植入体内后12周可在肌肉组织内形成类骨组织，显示细胞具有体内成骨能力。上述实验证实，本研究分离到的兔骨髓MSCs具有干细胞的特性，在体外能够较方便地大量扩增，同时该细胞体内外均具有成骨细胞分化潜能，为下一步的体内研究打下基础。 我们通过合适的方法，制成聚DL一乳酸/磷酸三钙/J型胶原复合物，其性能上互相取长补短，将TCP引入聚DL--乳酸可改善聚 DL--乳酸机械性能差，降解速度快，骨结合力弱等缺点。将I型胶原引入基质材料可显著提高材料与组织细胞的相互作用，利于细胞豁附。本研究所分离的兔BMSCS接种于PDLL刀TCP后的扫描电镜结果显示，MSCS不仅勃附于材料表面，而且能够移行入三维支架材料内部，说明我们所设计材料的孔径及孔隙率较为合适，在移植于动物体内后这种结构可提供宽大的表面积和空间，利于细胞粘附生长，细胞外基质沉积，营养和氧气进入，代谢物产出，也有利于血管和神经长入。 在动物体内骨缺损修复研究部分，本研究采用了大段骨缺损模型(1 .scm)，同时设计了三个实验组。A组为材料复合细胞组;B组只用材料而不加细胞;C组为空白对照组，即无细胞无材料组。 术后2周X线片显示C组(无材料、无细胞)只有沿尺侧骨膜部分成骨，中间仍缺损。A组(细胞+材料)有较明显的成骨反应，B组(材料)材料与骨折部位空隙明显，无明显成骨反应。由此可见材料中的MSCS已经发挥其种子细胞的作用，从而启动其成骨发生过程。此结果与体外成骨细胞诱导分化结果较为一致。术后X线片显示，A、B组材料自4周开始出现局部降解，8周后随着骨量的明显增加X线透射率减低，12周时兔大段骨缺损已基本修复，但A组修复明显较B组好，而C组沿尺侧部分成骨，挠侧仍有缺损。 为进一步研究MSCs在体内的成骨过程，我们对MSCS体内骨组织修复过程进广摘要一4-行了连续的组织学观察。发现2周时细胞复合材料组即有成骨细胞形成及胞外基质分泌，8周时可见新生血管形成，12周时出现部分类骨结构。电镜切片观察也获得了相近的结果。提示MSCS复合生物材料后可在损伤局部自发启动体内成骨过程，和骨折等病理状态下的骨修复相似，但成骨速度远较生理过程缓慢，而且在观察的时间段内未出现完整的骨缺损修复。 总之，本实验建立了一种简便可行的兔MSCs培养方法，细胞增殖能力强，并可定向分化为成骨及脂肪细胞。利用大段骨缺损模型的研究发现，体外培养的MSCS接种PDL