基因编辑技术因其可以直接对基因组进行改造而被广泛应用于单基因遗传病治疗的研究中。β-地中海贫血是由β-珠蛋白基因突变造成的,通过提高红细胞内的γ-珠蛋白的表达可以减轻β-地中海贫血患者的症状。有研究表明,利用慢病毒载体递送CRISPR/Cas9系统靶向CD34~+造血干/祖细胞中γ-珠蛋白基因的启动子区,模拟遗传性胎儿血红蛋白持续存在症病人中天然存在的γ-珠蛋白基因启动子区-102到-114之间13bp的缺失,可以破坏转录抑制因子BCL11A在γ-珠蛋白基因启动子区的结合位点,进而提高细胞内γ-珠蛋白的表达水平,但是这种方法并不利于临床转化,一是因为慢病毒载体在人的造血干细胞中的转导效率低,二是因为慢病毒载体的随机整合会有潜在致瘤风险,而且Cas9蛋白的持续表达可能增加脱靶风险。为了能够创建直接用于临床的β-地中海贫血基因编辑基因治疗的技术平台,在本课题中,我们探究了Cas9蛋白在人的CD34~+造血干/祖细胞中高效编辑的条件。我们发现,通过合成针对γ-珠蛋白基因启动子区-102到-114位点的sgRNAs,并对其两端进行了化学修饰,利用电穿孔将Cas9蛋白和经化学修饰的sgRNA-1以核糖核蛋白复合物的形式递送到β-地中海贫血患者来源的CD34~+造血干/祖细胞中进行编辑,在无分选的情况下,CD34~+细胞中的平均编辑效率可以达到80%以上。经过红系分化,编辑后的细胞内γ-珠蛋白mRNA相对于α-珠蛋白mRNA的平均表达水平可提高至126%,γ-珠蛋白链相对于α-珠蛋白链的平均含量可提高至64%,脱核率也提高至接近正常人的CD34~+造血干/祖细胞红系分化后的细胞脱核率,而且不会产生脱靶效应。这些结果表明CRISPR/Cas9系统核糖核蛋白的递送方式可以高效编辑CD34~+造血干/祖细胞的同时避免了慢病毒载体所带来的安全隐患。CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑的本质是产生双链断裂,为了开发一种不依赖双链断裂的β-地中海贫血的基因编辑疗法,我们尝试利用碱基编辑器hA3A-BE3来破坏BCL11A在γ-珠蛋白基因启动子区的结合以提高γ-珠蛋白的表达,通过电穿孔将密码子优化的hA3A-BE3蛋白和sgRNA-2递送到β-地中海贫血患者来源的CD34~+造血干/祖细胞中,使γ-珠蛋白基因启动子区-114和-115处的胞嘧啶突变为胸腺嘧啶,虽然编辑效率只有大约15%,但是相对于未编辑细胞,编辑后的细胞内γ-珠蛋白mRNA相对于α-珠蛋白mRNA的平均水平至少提高了6.5倍。综上所述,本研究优化了CRISPR/Cas9靶向γ-珠蛋白基因启动子区以治疗β-地中海贫血的编辑体系,从概念上证明了碱基编辑技术可以用于诱导γ-珠蛋白的表达,为β-地中海贫血的基因治疗提供了新的参考。