仿刺参Apostichopus japonicus (Selenka 1867)作为棘皮动物门的代表性物种之一,是我国水产养殖业中商业价值较高的经济物种,随着养殖规模的发展,仿刺参养殖已逐渐成为我国水产养殖业的支柱产业。本研究利用2b-RAD (2b-restriction site-associated DNA)技术,对仿刺参杂交家系子一代个体进行了高通量的SNP标记的开发。构建了高密度、高精度的仿剌参遗传连锁图谱,进行了生长性状的精细定位。为仿刺参全基因组测序以及其他基因组学和遗传学研究提供了丰富的信息和理论基础。同时也为仿刺参生长机制和分子标记辅助育种提供了理论和物质基础。1.作图家系的选择及仿刺参2b-RAD测序文库车的构建本研究中建立遗传图谱的家系的构建方法采用“双假拟测交”(double pseudo-testcross)策略,有目的地挑选了达到性成熟期的生长性状优良的个体分别作为建立家系的父母本,构建了9个“同父异母”的全同胞家系。在家系子代生长到1龄的时间点,进行采样和后期的家系鉴定,最终确定用于构建遗传图谱的家系材料。以杂交家系两个亲本和子一代100个个体的基因组DNA为实验材料,经BsaXI限制性酶切得到随机分布于基因组各处的33bp的DNA片段；酶切片段与带有选择性碱基的特异性接头相连；通过两轮PCR扩增反应向测序文库中引入特定Barcode序列。测序文库构建完成后首先随机选取测序文库进行克隆测序,而后又对两个亲本和随机的10个子代个体独立重复的进行了测序文库构建和测序。以验证本研究中实验操作的稳定性和实验技术的可重复性。2.仿刺参高密度遗传连锁图谱的构建本研究在经过标签聚类、参考位点的建立、子代标签与参考位点的比对等步骤的测序数据处理,以及子代个体分型率的筛选和孟德尔分离比的筛选后,共计获得11306个位点用于后期遗传连锁图谱的构建。其中用于母本连锁图谱构建的位点为6311个,用于父本连锁图谱构建的位点为5517个,亲本共享的SNP标记总数为522 (p-value=0.05).本研究选择使用的遗传连锁图谱作图软件为Joinmap 4.0,针对该软件自身计算容量的限制,制定了如下图谱构建流程：对作图标记进行分群；MSTMap软件初步计算SNP标记的遗传距离和相对位置：定位遗传距离相同的SNP位点,定义为cluster,选出每个cluster中信息含量最高的unique位点代表同一cluster内的其他位点保留在数据集中；去除cluster后的数据集利用Joinmap 4.0进行遗传距离的计算,得到雌、雄遗传连锁图谱；利用MergeMap软件进行图谱整合；将cluster回填到图谱中相应的unique位点的位置；分别绘制出雌、雄连锁图谱和整合图谱,统计各图谱所提供的信息。最终共计7839个SNP位点被成功的定位到仿刺参遗传连锁图谱上,图谱总长度为3706.6 cM,包含22个连锁群,标记间的平均间隔为0.47 cM。此图谱覆盖了99.57%的基因组,是目前已知的研究成果中棘皮动物构建的标记密度最高的遗传连锁图谱。3.仿刺参生长性状的连锁、关联分析与重要候选基因的定位在构建的遗传连锁图谱的基础上,进行与仿刺参生长性状相关的连锁分析,结果显示在5号连锁群上存在一个QTL区间的LOD值高于相对应的阈值(LOD=12.3),此QTL区间包含了3个与仿刺参生长性状呈显著相关的SNP位点。这3个QTL位点定位于第5号连锁群的79.63-80.01 cM区间,共计可以解释19.8%的仿刺参作图个体的生长性状表型差异。关联分析结果与连锁分析结果基本一致。对于重要候选基因的定位,首先将该区域中相互连锁的位点的原始数据标签提取出来,将其比对到本实验室正在进行拼接的仿刺参全基因组测序数据中,选取唯一的比对结果,确定为标签上下游的DNA序列信息,对其进行功能注释,得到编码的蛋白序列,而后进行BlastP比对,确定基因的种类和功能。本研究成功锁定了一个名为RBBP5 (retinoblastoma-binding protein 5)的基因,该基因在已有研究中被证实在细胞增殖过程中起着重要的调节作用。本研究中构建的遗传连锁图谱在仿刺参大规模QTL作图和分子标记辅助育种(MAS)中都表现出了显著的优势,并能够为进一步的染色体核型分析和全基因组序列拼接提供基础。