研究背景乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一。有资料显示,在美国,2011年新增的乳腺癌病例数达23万,成为女性恶性肿瘤的首位：另有近4万妇女死于乳腺癌。据统计,我过乳腺癌发病率占全身各种恶性肿瘤的7%-10%,女性乳腺癌的发病率也呈逐年上升趋势。在过去10年间,上海、北京和深圳等一些大城市乳腺癌发病率大幅上升,甚至已经占女性恶性肿瘤之首。乳腺癌严重干扰了女性的正常生活,影响着女性的身心健康,甚至危及生命。长期以来,如何有效地预防和治疗乳腺癌一直成为目前肿瘤学研究的热点。随着现代分子生物学在乳腺癌研究领域的不断发展和应用,人们逐渐发现乳腺癌具有高度异质性的特点,各乳腺癌患者之间存在明显的个体差异。人们通过基因表达谱的类型将乳腺癌分成了各种分子亚型。不同分子亚型的乳腺癌具有不同的生物学行为及治疗敏感性。根据乳腺癌患者的临床分期,同时结合肿瘤的分子亚型对乳腺癌患者进行相应的个体化治疗已经成为乳腺癌治疗领域中一种非常重要的治疗模式。目前,人们根据雌激素受体(estrogen receptor,ER)和孕激素受体(progesterone receptor,PR)的表达情况,以及是否存在表皮生长因子受体2(the epidermal growth factor receptor-2,HER-2)的扩增/过表达将乳腺癌分为不同的分子亚型。其中,ER和PR均表达阴性,同时不存在HER-2过表达的乳腺癌被称为“三阴”型乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC),其在所有乳腺癌病例中所占比例约为20%。人们对“三阴”型乳腺癌的发生和发展机制仍缺乏了解。在生物学行为上,“三阴”型乳腺癌其具有更好的侵袭性,更易发生复发和远处转移,患者预后更差。在临床工作中,“三阴”型乳腺癌患者因缺乏针对性的治疗而成为预后最差的分子亚型。在细胞正常的进行生长、增殖和凋亡过程中,信号转导通路起着非常重要的调控作用。一旦调控失衡就有可能引起细胞异常生长和持续的分裂。维持蛋白的磷酸化和去磷酸化修饰之间的平衡是细胞正常信号转导中的重要组成部分。在这一过程中,目前研究较多的是受体酪氨酸激酶(PTKs)和酪氨酸磷酸酶(PTPs)。酪氨酸激酶与酪氨酸磷酸酶在细胞内蛋白磷酸化水平的调节过程中起着非常重要的作用。有学者认为在乳腺癌的发生和发展中存在细胞内磷酸化水平的失衡,即酪氨酸磷酸酶活性降低及/或酪氨酸激酶活性增强,从而导致乳腺上皮细胞的恶性生长、分化和增殖。表皮生长因子受体是酪氨酸激酶中最大的一类酶联受体。表皮生长因子受体家族(也称为ErbB受体家族)包括EGFR(HER1/ErbB-1)、HER2(ErbB-2/neu)、 HER3(ErbB-3)以及HER4(ErbB-4)这四种相关的受体酪氨酸激酶。。通过与配体以特异并高亲和力的形式结合,原本以无活性的单体形式存在于细胞膜表面的受体便形成同源二聚体或者异源二聚体,随后受体酪氨酸激酶被激活而启动下游的信号传导通路,从而调控细胞增殖、分化等过程。表皮生长因子的过度激活可导致细胞内分裂增殖信号的不断传递,将信号转导至细胞内膜和细胞核,最终引起细胞持续分裂、增殖、侵袭、转移、肿瘤的血管生成,因此常与肿瘤转移和预后不良等相关。有研究发现14%至90%的乳腺癌组织中存在EGFR的过度表达。EGFR表达阳性的细胞分化差、侵袭性更高、具有淋巴结早期转移的倾向、且对内分泌治疗产生抵抗。人们发现有20%-30%的乳腺癌患者存在HER-2的高表达或基因扩增。Her-2高表达的乳腺癌恶性程度高,远处转移及复发率高,患者的预后差。目前,针对HER-2高表达乳腺癌的抗肿瘤分了靶向药物治疗曲妥珠单抗(Trastuzumab)在临床中的应用已取得了令人鼓舞的疗效。人们对酪氨酸激酶进行系统研究的同时,对酪氨酸磷酸酶的了解也在不断进行。第一个具有酪氨酸特异性的磷酸酶于1980年被发现。在接下来的20年中,PTPs家族的成员已增加到至少107个,人们对于酪氨酸磷酸酶在肿瘤的发生和发展过程中的作用已经有了越来越深入的认识。蛋白酪氨酸磷酸酶PTPN12(又称PTP-PEST)于1993年由Yang运用聚合酶链反应(PCR)的方法从人骨骼肌中发现。人类PTPN12基因位于染色体7q11.23,其编码的蛋白大小约60KD,含有510个氨基酸。2001年,Dominique发现PTPN12通过诱导Shc.Pyk2, Fak and Cas的去磷酸化和使RAS-MAPK通路失活,最终对淋巴细胞的活化起到负性调控作用。随后有研究发现PTPN12在结肠癌、卵巢癌以及成纤维细胞中调控细胞的粘附、迁移和运动,进而认为其有潜在的调控肿瘤细胞转移的作用。2011年,Sun发现PTPN12可以有效抑制乳腺上皮细胞的增殖和转化。PTPN12通过负性调控以EGFR和HER-2为中心的酪氨酸磷酸酶传导通路而发挥抑制细胞恶性增殖的作用。多靶点酪氨酸激酶抑制剂的联合使用可以使“三阴”型乳腺癌细胞系的增殖能力和成瘤能力严重受损。同时,大量“三阴”型乳腺癌细胞和肿瘤组织中均存在PTPN12的缺失表达。在PTPN12缺失的乳腺癌细胞中,一旦恢复PTPN12的功能,细胞的生长和转移潜能就能受很大程度的破坏。因此,PTPN12被认定为“三阴”型乳腺癌中的新型抑癌基因。目的对于中国人群中PTPN12与乳腺癌的关系,目前还没有出现报道。本研究通过采用免疫组织化学染色的方法,探讨PTPN12蛋白在中国人群中不同分子亚型乳腺癌中的表达情况,分析PTPN12的表达与受体酪氨酸激酶EGFR和Her-2的表达是否相关,并探讨PTPN12蛋白的表达与乳腺癌患者的临床病理特征的关系,同时结合临床随访资料进行回顾性分析PTPN12的表达与患者总生存时间之间的关系。为进一步研究PTPN12基因在乳腺癌发生和发展过程中的作用、机制奠定基础；为乳腺癌的预后判断以及治疗靶点的选择提供初步的证据。方法：1.PTPN12在不同分子分型乳腺癌组织中的表达收集2005年至2009年南方医院收治的84例乳腺癌患者的病理及临床资料。所有患者均已知ER、PR以及HER-2的表达情况。其中有“三阴”型乳腺癌患者50例,非“三阴”型乳腺癌患者34例,采用免疫组织化学染色方法检测组织中PTPN12的表达,并分析PTPN12在不同分子分型乳腺癌患者中的表达情况；2.PTPN12与分子分型相关蛋白表达的关系采用免疫组织化学染色方法检测组织中EGFR的表达,并分析EGFR在不同分子分型乳腺癌患者中的表达情况；分析PTPN12的表达与ER、PR、HER-2以及EGFR的关系。3.PTPN12的表达与临床病理特征的关系整理84例乳腺癌患者的发病年龄、原发肿瘤大小、淋巴结状态、有无远处转移、临床分期等临床病理资料,分析PTPN12蛋白表达水平与各临床病理参数之间的关系。4.PTPN12的表达与患者预后的关系分析PTPN12蛋白表达与乳腺癌患者总生存期的关系；建立COX回归模型,对各项指标与生存期的关系进行统计分析。5.统计学方法：运用SPSS13.0统计分析软件包对实验数据进行统计分析,采用以下统计分析方法：“三阴”型乳腺癌和非“三阴”型乳腺癌中PTPN12的阳性表达率的比较用x2检验；“三阴”型乳腺癌和非“三阴”型乳腺癌中PTPN12的表达强度差异采用Mann-whitney U非参数检验方法；“三阴”型乳腺癌和非“三阴”型乳腺癌中EGFR的阳性表达率的比较用x2检验；PTPN12与EGFR各表达水平的相关性分析采用Spearman秩相关性分析；PTPN12蛋白表达的影响因素分析采用logistic回归分析的方法；对PTPN12以及各个临床病理参数与乳腺癌患者的总生存时间之间的关系采用Kaplan-Meier法进行生存分析,对PTPN12及多个临床病理参数与患者的总生存时间的关系进行COX回归分析；以0.05为检验水准,P<0.05视为差异有统计学意义。结果：第一章、PTPN12在不同分子分型乳腺癌组织中的表达1.PTPN12在乳腺癌细胞的细胞浆和(或)细胞膜中表达。在50例“三阴”型乳腺癌组织中,PTPN12的各级表达强度所占比例分别为：“-”占42.0%(21/50),“+”占26.0%(13/50),“++”占28.0%(14/50),“+++”占4%(2/50)。在34例非“三阴”型乳腺癌组织中,PTPN12的各级表达强度所占比例分别为：“-”占20.6%(7/34),“+”占23.5(8/34),“++”占29.4%(10/34),“+++”占26.5%(9/34)。非“三阴”型乳腺癌组织中PTPN12的表达强度显著高于“三阴”型乳腺癌组织(P<0.05)。在“三阴”型乳腺癌组织中PTPN12的缺失表达率为42.0%(21/50)。在非“三阴”型乳腺癌组织中PTPN12的缺失表达率为20.6%(7/34)。“三阴”型乳腺癌组织中PTPN12的缺失表达率明显高于非“三阴”型乳腺癌组(P<0.05)2.EGFR在乳腺癌细胞的细胞膜和胞浆中表达。EGFR在“三阴”型乳腺癌中的表达阳性率为76.0%(38/50)。非“三阴”型乳腺癌中PTPN12的表达阳性率为47.1%(16/34)。“三阴”型乳腺癌和非“三阴”型乳腺癌中EGFR表达的差异具有统计学意义(P<0.05)。3.EGFR和PTPN12蛋白的表达水平具有显著的负相关关系(rs=-0.264P=0.015)。4.PTPN12的表达与HER-2的表达存在负相关关系,具有统计学意义(rs=-0.250P=0.022),PTPN12的表达与ER的表达、PR的表达均不具有明显相关性(P>0.05)第二章、PTPN12的表达与临床病理特征以及患者预后的关系1.logistic回归分析的结果显示PTPN12蛋白的表达与患者的发病年龄、HER-2的表达以及EGFR的表达呈负相关关系(P值均小于0.05)。PTPN12的表达与患者的原发肿瘤大小、淋巴结转移状态、有无远处转移以及临床分期无明显相关性。2. Kaplan-Meier生存分析的结果显示PTPN12表达阳性患者的总生存时间显著长于PTPN12表达为阴性患者的总生存时间(P<0.05)而在“三阴”型乳腺癌患者和非“三阴”型乳腺癌患者两个亚组中均未发现PTPN12的表达与患者的生存时间存在显著关系(P>0.05)3.运用Kaplan-Meier法进行统计学分析的结果显示PTPN12的表达状态、患者的临床分期以及淋巴结转移状态影响乳腺癌患者总生存时间(P<0.05),而患者的年龄、肿瘤大小、远处转移、ER、PR、HER-2、EGFR的表达对乳腺癌患者的总生存时间无显著的影响(P>0.05)4.COX多因素回归分析的结果显示PTPN12是影响乳腺癌患者总生存时间的独立因素,PTPN12表达阳性患者生存期长于PTPN12表达为阴性的患者(B=-1.043,P<0.05)。结论：1.国外的研究发现PTPN12在“三阴”型乳腺癌中的缺失突变率高于其他分子分型肿瘤,而我们的研究结果也表明中国人群中PTPN12蛋白的表达缺失在“三阴”型乳腺癌患者中更常见。因此有理由认为PTPN12在“三阴”型乳腺癌中的表达缺失率更高是一种普遍现象。这一结果从一个角度支持PTPN12为“三阴”型乳腺癌中的抑癌基因这个结论。PTPN12可能作为抗“三阴”型乳腺癌治疗的潜在靶点。2. PTPN12对EGFR/HER-2有负性调控的作用,也即EGFR/HER-2是PTPN12发挥抑制肿瘤作用的靶点。针对EGFR和HER-2等酪氨酸激酶的多靶点药物可能在临床上乳腺癌患者有效。3. PTPN12是乳腺癌患者预后的独立预测因子。PTPN12表达阳性的乳腺癌患者的生存时间显著长于PTPN12表达阴性的患者。因此PTPN12可能作为评估乳腺癌患者预后的指标。