论文部分内容阅读
乳脂肪是牛奶的主要营养成分,可以为人类提供营养和能量,因此生产具有足够乳脂肪的优质牛奶是健康食品的发展趋势。然而我国牛奶中乳脂肪的含量普遍偏低,削弱了乳制品在国内外市场的竞争力,因此提高乳产量及乳脂肪含量成为我们亟待解决的问题。奶牛乳脂肪合成的前体物主要是乙酸和p-羟丁酸,还有乳腺从血液摄取的长链脂肪酸,以前的研究主要侧重于脂肪酸对奶牛生产性能的影响,而有关脂肪酸与乳腺乳脂肪合成功能基因相互作用的研究较少。本课题首先利用qRT-PCR和Western blotting筛选干奶期奶牛、低乳品质奶牛和高乳品质奶牛乳腺组织与乳脂肪合成相关的差异表达基因和差异表达蛋白,作为后续体外实验的评价指标。采用组织块培养法构建奶牛乳腺上皮细胞(DCMECs)模型。DCMECs添加乙酸钠、p-羟基丁酸钠、乙酸钠和p-羟基丁酸钠混合物、软脂酸和硬脂酸,qRT-PCR检测DCMECs脂肪酸摄取、转运、活化相关蛋白基因(CD36、FABP3、ACSL1、ACSS2)、脂肪酸从头合成、去饱和酶基因(ACC、FAS、SCD)、甘油三酯合成酶相关基因(GPAT、AGPAT6、DGAT1)和乳脂肪合成转录调控因子(PPARy、PPARGC1A、SREBP1、 INSIG1、SCAP)相关基因的mRNA表达,Western blotting检测乳脂肪合成转录调控因子的蛋白表达,酶活性试剂盒检测甘油三酯合成酶活性变化。采用细胞免疫荧光法检测PPARγ的胞内定位情况。对DCMECs的PPARy进行基因沉寂和超表达,通过培养基中甘油三酯含量确定PPARγ基因沉寂和超表达的DCMECs对各脂肪酸的浓度需求变化,同时采用qRT-PCR、Western blotting和酶活性试剂盒检测各脂肪酸对PPARγ基因沉寂和超表达的DCMECs乳脂肪合成相关基因表达、转录调控因子蛋白表达及甘油三酯合成酶活性的影响。本研究结果显示：1.与干奶期奶牛相比,高乳品质奶牛和低乳品质奶牛乳腺CD36、FABP3、ACSS2、 ACSL1、ACC、FAS、SCD、GPAT、AGPAT6、DGAT1、PPARy、PPARGCIA、SREBP1、INSIG1和SCAP的mRNA表达均显著升高(P<0.05),同时高乳品质奶牛乳腺这些基因的mRNA水平也显著高于低乳品质奶牛(P<0.05)。与干奶期奶牛乳腺相比,高乳品质奶牛和低乳品质奶牛乳腺CD36、FABP3、PPARy、PPARGC1A、SREBP1、INSIG1和SCAP的蛋白表达显著升高(P<0.05),同时高乳品质奶牛乳腺这些蛋白的表达量也显著高于低乳品质奶牛(P<0.05)。2.不同脂肪酸对DCMECs乳脂肪合成影响的结果(1)12mmol/L乙酸钠显著提高FABP3、ACSS2、ACC、FAS、SCD的mRNA表达(P<0.05),明显降低CD36的mRNA表达(P<0.05),显著上调PPARy、PPARGCIA、 SREBP1、INSIG1和SCAP的mRNA表达水平和蛋白表达水平(P<0.05),并显著增强GPAT、AGPAT6、DGAT1的mRNA表达和酶活性(P<0.05)；(2)1mmol/Lp-羟基丁酸钠也显著上调FABP3、ACSS2、ACC、FAS、SCD的mRNA表达水平(P<0.05),显著降低CD36的mRNA表达(P<0.05),同时能显著增强PPARy、PPARGCIA、SREBP1、INSIG1和SCAP的mRNA表达和蛋白表达(P<0.05),明显提高GPAT、AGPAT6、DGAT1的mRNA表达和酶活性(P<0.05)；(3)8mmol/L乙酸钠和1mmol/L β-羟基丁酸钠协同作用显著提高CD36、FABP3、ACSL1、ACSS2、ACC、FAS、SCD的mRNA表达水平(P<0.05),二者协同作用能明显促进PPARγ、PPARGC1A、SREBP1、INSIG1和SCAP的mRNA表达和蛋白表达(P<0.05),并显著提高GPAT、AGPAT6、DGAT1的mRNA表达和酶活性(P<0.05)；(4)150μmol/L软脂酸能显著提高CD36、FABP3、ACSL1、ACSS2、SCD的mRNA表达(P<0.05),显著提高GPAT、AGPAT6、DGAT1的nRNA表达及酶活性(P<0.05),并显著上调PPARγ、PPARGC1A、SREBP1、INSIG1和SCAP的的mRNA表达和蛋白表达(P<0.05)；(5)125μmol/L硬脂酸也能显著上调CD36、FABP3、 ACSL1、ACSS2、SCD的mRNA表达(P<0.05),显著提高GPAT、AGPAT6和DGAT1的mRNA表达及酶活性(P<0.05),并显著上调PPARγ、PPARGC1A、SREBP1、INSIG1和SCAP的mRNA表达水平和蛋白表达水平(P<0.05)。3.激光共聚焦检测发现PPARγ主要定位于DCMECs的细胞核中。4.与空白对照组和阴性对照组相比,PPARγ基因沉寂的DCMECs的CD36、FABP3、 ACSL1、ACC、FAS、SCD mRNA水平显著降低(P<0.05),GPAT、AGPAT6、DGAT1的mRNA表达及酶活性显著降低(P<0.05), PPARγ、PPARGC1A、SREBP1、INSIG1和SCAP的mRNA表达和蛋白表达显著降低(P<0.05)；与非转染组和pGCMV-IRES-EGFP组相比,pGCMV-IRES-EGFP-PPARy组DCMECs的CD36、FABP3、ACSL1、ACC、FAS、SCD的mRNA水平显著上调(P<0.05), GPAT、AGPAT6、DGAT1的mRNA表达及酶活性明显升高(P<0.05),PPARy、PPARGCIA、SREBP1、INSIG1和SCAP的mRNA表达和蛋白表达显著升高(P<0.05)。5.与正常DCMECs对各脂肪酸的需要量相比,PPARγ基因沉寂的DCMECs对各脂肪酸需求量增高,而PPARγ超表达的DCMECs对各脂肪酸需求量减少。6.不同脂肪酸对PPARy基因沉寂DCMECsL脂肪合成影响的结果(1)添加16mmol/L乙酸钠的PPARγ基因沉寂DCMECs与未添加乙酸钠的PPARγ基因沉寂DCMECs相比,FABP3、ACSL1、ACSS2、ACC、FAS、SCD、PPARGC1A、 INSIG1和SCAP的mRNA表达明显升高(P<0.05),PPARγ、SREBP1的mRNA表达和蛋白表达及GPAT、AGPAT6、DGAT1的mRNA表达和酶活性也显著提高(P<0.05)；(2)添加1mmol/L β-羟基丁酸钠的PPARy基因沉寂DCMECs与未添加p-羟基丁酸钠的PPARγ基因沉寂DCMECs相比,]ABP3、ACSL1、ACSS2、ACC、FAS、SCD、PPARGC1A、INSIG1和SCAP的mRNA表达明显上调(P<0.05), PPARγ、SREBP1mRNA表达和蛋白表达及GPAT、AGPAT6、DGAT1的mRNA表达和活性也明显升高(P<0.05)；(3)8mmol/L乙酸钠和1.25mmol/Lp-羟基丁酸钠协同作用处理PeARγ基因沉寂的DCMECs与未添加乙酸钠和p-羟基丁酸钠的PPARγ基因沉寂DCMECs相比,CD36、FABP3、ACSL1、 ACSS2、ACC、FAS、SCD、PPARGC1A、INSIG1和SCAP mRNA表达水平明显升高(P<0.05), PPARγ、SREBP1的mRNA表达和蛋白表达明显增加(P<0.05),GPATAGPAT6、DGAT1的mRNA表达和活性也显著增强(P<0.05)：(4)添加175μmol/L软脂酸的PPARγ基因沉寂DCMECs与未添加软脂酸的PPARγ基因沉寂DCMECs相比,CD36、FABP3、ACSL1、ACSS2、SCD、PPARGC1A、INSIG1和SCAP mRNA表达水平明显升高(P<0.05), GPAT、AGPAT6、DGAT1mRNA表达和酶活力及PPARγ、SRJEBP1的mRNA表达和蛋白表达显著提高(P<0.05)；(5)添加150μmol/L硬脂酸的PPARγ基因沉寂DCMECs与未添加硬脂酸的PPARy基因沉寂DCMECs相比,CD36、FABP3、ACSL1、 ACSS2、SCD、PPARGC1A、INSIG1、和SCAP的mRNA表达明显升高(P<0.05),GPAT、AGPAT6、DGAT1的mRNA表达水平和酶活力及PPARγ、SREBP1mRNA表达和蛋白表达也明显上调(P<0.05)。7.不同脂肪酸对PPARγ基因超表达DCMECs乳脂肪合成影响的结果(1)添加8mmol/L乙酸钠的PPARγ基因超表达DCMECs与未添加乙酸钠的PPARy基因超表达DCMECs相比,FABP3、ACSL1、ACSS2、ACC、FAS、SCD、PPARGCIA.INSIG1和SCAP mRNA表达水平明显上调(P<0.05), GPAT、AGPAT6、DGAT1mRNA表达和活性及PPARy、SREBP1mRNA表达和蛋白表达显著升高(P<0.05)；(2)添加0.75mmol/L β-羟基丁酸钠的PPARγ基因超表达DCMECs与未添加β-羟基丁酸钠的PPARγ基因超表达DCMECs相比,FABP3、ACSL1、ACSS2、ACC、FAS、SCD、PPARGCIA.INSIGI和SCAP mRNA表达明显升高(P<0.05),GPAT、AGPAT6、DGAT1mRNA表达和酶活性及PPARy、SREBP1mRNA表达和蛋白表达水平显著上调(P<0.05)；(3)12mmol/L乙酸钠和0.75mmol/L β-羟基丁酸钠协同作用的PPARγ基因超表达DCMECs与未添加乙酸钠、β-羟基丁酸钠的PPARγ基因超表达DCMECs相比,CD36、FABP3、ACSL1、 ACSS2、ACC、FAS、SCD、PPARGCIA、INSIG1和SCAP mRNA表达都明显上调(P<0.05), GPAT、AGPAT6、DGAT1mRNA表达和活性及PPARγ、SREBP1mRNA表达和蛋白表达显著升高(P<0.05);(4)添加125μmol/L软脂酸的PPARγ基因超表达DCMECs与未添加软脂酸的PPARγ基因超表达DCMECs相比,CD36、FABP3、ACSL1、ACSS2、 SCD、PPARGC1A、INSIG1和SCAP mRNA表达水平显著升高(P<0.05),GPAT、AGPAT6、DGAT1mRNA表达和活性及PPARyγ、SREBP1的mRNA表达和蛋白表达也显著增加(P<0.05);(5)添加100μmol/L硬脂酸的PPARγ基因超表达DCMECs与未添加硬脂酸的PPARγ基因超表达DCMECs相比,CD36、FABP3、ACSL1、ACSS2、SCD、 PPARGC1A、INSIG1和SCAP mRNA表达明显上调(P<0.05), GPAT、AGPAT6、DGAT1的mRNA表达和活性及PPARy、SREBP1mRNA表达和蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。本研究表明乳脂肪合成前体物乙酸钠、β-羟基丁酸钠、乙酸钠与β-羟基丁酸钠协同作用、软脂酸和硬脂酸通过促进DCMECs PPARy的mRNA表达和蛋白表达,进而参与调节DCMECs脂肪酸摄取、转运、活化相关蛋白,脂肪酸从头合成酶和去饱和酶,甘油三酯合成酶,乳脂肪合成转录调控相关因子的mRNA表达和蛋白表达,促进乳脂肪合成。DCMECs PPARy基因沉寂和超表达研究表明,PPARy是DCMECs乳脂肪合成的关键转录调控因子,其对奶牛乳脂肪合成的调节起枢纽作用。PPARγ基因沉寂和超表达的DCMECs对各种脂肪酸的需求浓度发生改变,同时各种脂肪酸能调节PPARy基因沉寂和超表达的DCMECs乳脂肪合成相关基因和蛋白的表达,这进一步说明脂肪酸通过PPARy而调节乳脂肪合成。本研究为反刍动物乳脂肪合成的营养调控提供参考,对利用营养元素改善乳脂肪及乳品质有重要指导意义。