胡萝卜可生食，耐储藏，产量高，易种植，而且是重要的婴幼儿早期食品，同时转基因胡萝卜对环境具有更高的安全性等优点，因此可以作为优良的生产口服疫苗的植物载体，但是适合在胡萝卜中，尤其是在胡萝卜直根中特异表达外源蛋白的启动子元件并不成熟。目前用于构建植物表达载体的启动子主要是组成型启动子(如花椰菜花叶病毒CaMV 35S启动子)，相对于组织特异性启动子，它易造成植物营养浪费。因此我们选择了胡萝卜直根特异表达的液泡转化酶Ⅱ型同工酶(sⅡ)基因的启动子，并希望利用该启动子建立一个了胡萝卜直根特异性高效表达体系。 本实验首先根据已发表的s Ⅱ基因的启动子序列，利用PCR方法扩增得到全长启动子片段S1，并与GUS报告基因构建了植物表达载体pS1，通过农杆菌LBA4404真空渗透转化胡萝卜不同发育时期(播种后的第3，6，9，12，15，20周)的不同组织(叶片，叶柄，直根)中，3-4天后，检测报告基因GUS的瞬间表达。同时以含有CaMV 35S启动子为阳性对照；以缺失CaMV 35S启动子的N为阴性对照。GUS组织化学染色结果表明，阳性对照35S在不同发育时期，不同组织的胡萝卜材料上均有不同程度的GUS着色；阴性对照N在三种组织中均未检测到GUS着色；启动子S1只在15周的叶柄组织和直根组织中检测到GUS着色，且在直根的形成层及木质部着色程度较深，在周皮，韧皮部着色程度较浅。在荧光活性检测结果表明，阴性对照N在胡萝卜不同发育时期不同组织不表达GUS活性，而阳性对照35S则在不同发育时期的胡萝卜叶片，叶柄及直根组织都表达了较高的GUS活性。S1则表现出在9-15周的胡萝卜直根表达较高的GUS活性，而且GUS活性值与35S相当；在其它发育时期及其它组织中有较低的GUS活性值，结果证明检测GUS活性方法是非常灵敏的。为提高农杆菌介导的胡萝卜直根瞬间表达体系的表达效率，实验采用含有S1启动子构建的农杆菌LBA4404真空渗透发育12周的胡萝卜直根根片中，通过检测GUS荧光活性值的变化来选择最优条件。根据实验结果，最终选定的转化条件为：Silwet 1-77浓度：0.005％，渗透压力：0.04MP-0.06MP，渗透时间：1-4min，转化后培养时间：3-4天。由此我们利用真空渗透瞬间表达法研究了s Ⅱ基因的启动子在胡萝卜中表达的组织发育特异性及在直根中的高表达活性，同时建立起一套稳定高效的农杆菌介导的胡萝卜直根根片真空渗透瞬间表达体系。 为进一步探询s Ⅱ基因启动子的结构与功能，本文在全长启动子S1的基础上，用PCR方法扩增得到s Ⅱ基因启动子的5’系列缺失体(S2-S7)，并与报告基因GUS融合构建了七种植物表达载体pS2(1234bp)、pS3(674bp)、pS4(257bp)、pS5(136bp)、pS6(81bp)、pS7(56bp)。利用农杆菌介导的胡萝卜直根瞬间表达体系来检测这些植物表达载体表达GUS活性。GUS组织化学染色结果表明，除了缺失体S7没有使胡萝卜根片着色，其余缺失体转化的胡萝卜根片都有不同程度的GUS着色，其中E转化的胡萝卜根片着色范围较小，着色程度较浅，其它缺失体之间的GUS染色范围，染色程度差异不明显，对于直根的的四种组织来说，形成层及木质部着色程度较深，在周皮，韧皮部着色程度较浅。GUS荧光活性测定结果表明，启动子S4表达载体表达了最高的GUS活性，是全长启动子S1的2.11倍；S2是全长启动子S1的1.37倍； S5与全长启动子S1相近；而S6仅为全长启动子的44.45％，但仍然显著高于阴性对照N；S7与阴性对照N差异不显著。由此推测在-2766bp--1234bp和一674bp--257bp两段区域可能存在负调控元件，而在-1234bp--674bp和-257bp--56bp之间可能存在正调控元件。在启动子缺失分析的基础上，本实验利用5’RACE方法和生物信息学预测方法对该启动子序列进行分析，初步确定了该启动子的转录起始位点，其位于翻译起始位点上游26bp处的“A”。同时结合缺失分析结果和启动子预测软件(PLACE和PlantCARE)初步推测在S4-S5之间可能存在增强子序列。由此我们对这段序列做一个加倍，然后正向插入到S4的上游，形成ES构建。利用农杆菌介导的胡萝卜直根瞬间表达体系来检测ES构建表达GUS活性。结果加倍的ES表达GUS活性是加倍前S4的1.48倍，说明这段序列的确有增强效果，但增强作用的稳定性有待于进一步的实验论证。