柠檬苦素是一种高度氧化的四降三萜类植物次生代谢产物,具有抗癌、抗菌、镇痛抗炎以及抗艾滋病病毒(HIV)等多种生理活性。目前,柠檬苦素主要通过植物提取来获得,得率小且工艺繁琐。微生物发酵法生产生物活性物质耗时短、成本低、易于控制,占地小且利于植物资源的保护。本文以内生菌的特性为切入点,以富含柠檬苦素的沙田柚为研究对象,分离并鉴定了存在于沙田柚不同组织的内生菌,旨在筛选出能够自主发酵产生柠檬苦素的微生物并进行相关研究。论文主要研究内容和取得的结果如下:(1)沙田柚中内生菌的分离鉴定及抑菌特性研究。以沙田柚为分离源,对其皮、籽中的内生菌进行了分离,共得到5株微生物菌株。其中,3株分离于柚皮(P1、P、P9),2株分离于柚籽(Z1、Z2)。通过形态学及分子生物学鉴定,5株菌均属于芽孢杆菌属;采用牛津杯法测定5株内生菌的发酵液经不同方法处理后的样品(原液、浓缩液、乙酸乙酯提取液)对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌及铜绿假单胞菌的抑菌活性。结果表明,各菌株对不同病原菌的抑制作用体现出一定的多样性,其中菌株P、P9的发酵浓缩液和乙酸乙酯提取液对5种病原菌均有不同程度的抑制作用,对枯草芽孢杆菌的抑制效果最为明显;菌株P1、Z1及Z2发酵液的抑菌效果不显著。通过对发酵液中蛋白与非蛋白成分的抑菌性分析,结果显示菌株P、P1、Z1的有效抑菌成分主要集中在非蛋白成分中;菌株P9发酵液中,粗蛋白及非蛋白成分均能起到抑菌作用;菌株Z2发酵液中,粗蛋白对金黄色葡萄球菌有微弱抑制作用,而非蛋白成分对铜绿假单胞菌有明显抑制作用。(2)产柠檬苦素菌株的筛选。分别采用无机盐培养基、天然培养基1、天然培养基2三种不同的培养基对5株菌进行培养,利用高效液相色谱对发酵液中柠檬苦素进行检测,初步筛选出2株具有合成柠檬苦素能力的内生菌(P及P9),且在三种培养基中均检测到柠檬苦素。其中,在无机盐培养基中,菌株P的产量较大,为(2.961±0.12)mg/L,菌株P9的产量较小,为(0.151±0.08)mg/L;在添加了柚皮粉的天然培养基1中,菌株P和P9的产量明显升高,分别为(4.377±0.11)mg/L、(0.299±0.02)mg/L,约为无机盐培养基的2倍。对柠檬苦素产量较高的菌株P发酵液提取物进行质谱分析,检测出m/z=471.20([M+H]~+),493.18([M+Na]~+)的离子峰,其特征离子为m/z=161.06,425.20,与柠檬苦素标准品相同条件下的特征离子一致,可以判断此物质是柠檬苦素。表明柚子内生菌包含合成柠檬苦素的自然微生物,且其前体存在可以显著提高柠檬苦素产量。(3)菌株P合成柠檬苦素的发酵特性及条件优化。对菌株P的生长曲线和柠檬苦素产量曲线进行分析,发现P菌体生长量和柠檬苦素产生量呈一致趋势,在16 h生长量达最大值,同时柠檬苦素产量达最大值(3.176±0.13)mg/L。通过单因素试验(菌龄、葡萄糖含量及接种量)和响应面分析法确定了菌株P合成柠檬苦素的最优条件:菌龄15 h,葡萄糖浓度3.4 g/L,接种量16%,在该条件下柠檬苦素的最大产量的预测值为3.51 mg/L,验证值为(3.49±0.32)mg/L。