1、长效HSA/GH融合蛋白的优化设计目前临床使用的部分蛋白/多肽类药物由于分子量较小,在人体内的半衰期短,须频繁注射以维持药效,从而限制了其临床应用,如本文研究的人生长激素(human growth hormone, hGH)、人甲状旁腺激素PTH (1-34)(human parathyroid hormone1-34)。人血清白蛋白(HSA)融合技术是延长蛋白/多肽类药物半衰期的一种简便、灵活的技术,也是目前国内外生物制药研究的热点。在利用HSA融合目的蛋白实现长效的技术研究中,仍有一些基础问题需要解决。如目前所有报道的HSA融合蛋白的体外生物学活性均有不同程度的降低,说明了HSA对所融合的蛋白/多肽的活性位点的干扰。另外,有报道指出,HSA也有可能会影响所融合蛋白的正确折叠或者糖基化位点的暴露程度,导致重组表达的融合蛋白产物不均一。因此,在HSA融合蛋白的开发中有必要考察不同融合方向,连接肽的有无和长短对融合蛋白活性、稳定性的影响,综合考虑各种因素,从而选择一种最优选的融合方式。本文着重研究了连接肽的引入和长短对HSA/GH融合蛋白的体外生物学活性和稳定性影响,为HSA/GH融合蛋白的开发提供了一种优选设计,同时也为其他HSA融合蛋白的设计提供了参考。2、 HSA/GH融合蛋白免疫检测方法的建立目前市场上只有检测GH或者HSA的ELISA试剂盒,没有专门针对HSA/GH融合蛋白的ELISA试剂盒。而在药代动力学研究中,要检测到完整的HSA/GH分子才能准确反映HSA/GH在体内的代谢动力学过程。本文建立了一种能够检测HSA/GH融合蛋白完整分子的双抗夹心ELISA,其检测范围在2.156～69ng/ml,初步应用于大鼠体内的药代动力学研究,为HSA/GH融合蛋白进一步的临床前开发奠定了基础。3、HSA融合蛋白的高效毕赤酵母表达系统的建立酵母表达系统兼具了原核表达系统表达周期短、表达量较高、易于工业化高密度培养的优点以及真核表达系统对外源蛋白进行糖基化、磷酸化等翻译后修饰的特点,被公认为是一种表达大规模蛋白的强有力工具。研究也表明,酵母表达系统是目前用于HSA重组表达最高效、最经济的一种表达系统,利用毕赤酵母表达一系列HSA融合蛋白具有潜在优势,因此本课题组将毕赤酵母作为首选表达系统,应用于一系列HSA融合蛋白的研究。但在表达一系列HSA融合蛋白时发现,未经优化的毕赤酵母表达系统主要存在两大缺陷,影响了HSA融合蛋白的高效重组表达,严重制约了HSA融合蛋白的临床前研究进程：1)分泌表达过程中的降解问题；2)分泌表达效率普遍较低,使得发酵表达量的提升也非常有限。因此有必要对毕赤酵母表达系统进行优化,实现HSA融合蛋白的高效表达。3.1构建蛋白酶缺陷型宿主改善HSA融合蛋白的降解一系列HSA融合蛋白在毕赤酵母中表达时都存在不同程度的降解,若与HSA进行融合的蛋白/多肽对蛋白酶敏感,重组表达时的降解问题会更严重,更复杂。由于降解条带一般与完整的HSA融合蛋白性质相近,影响了后续重组蛋白的纯化制备。本文以其中一个典型的易降解蛋白——人血清白蛋白-人甲状旁腺激素(1-34)融合蛋白[HSA/PTH (1-34)]为研究对象,首先通过Western Blot、N端氨基酸测序以及质谱分析证明了表达产物中完整蛋白的存在,并对降解产物进行了表征。文献报道指出,PTH易被酵母中的一类yapsin蛋白酶降解,并且液泡蛋白酶也是导致外源蛋白在毕赤酵母中重组表达时发生降解的主要原因。毕赤酵母中的液泡蛋白酶已经研究的比较清晰,并且已经有敲除主要液泡蛋白酶的商品化蛋白酶缺陷型宿主(SMD1168宿主为proteinase A缺陷型,SMD1163为proteinase A和proteinase B双重缺陷型)。根据毕赤酵母基因组测序结果,毕赤酵母中的yapsin家族共存在7个成员(YPS1, YPS2, YPS3, YPS7, MKC7, YPS’, YPS"),但针对这7个yapsin成员的研究目前相对较少。本文利用同源重组的方法,构建了7个单一YPS敲除的毕赤酵母宿主。通过分析7种单一YPS缺陷宿主和proteinase A, proteinase B缺陷宿主对HSA/PTH (1-34)融合蛋白降解的影响,发现YPS1敲除和proteinase A敲除都有助于改善HSA/PTH (1-34)融合蛋白的降解。通过将YPS1和proteinase A同时敲除,降解得到最大程度的改善,与野生型GS115相比,完整蛋白的产率从30%提高到了80%。3.2多拷贝HSA融合基因整合与分子伴侣共表达相结合,提高HSA融合蛋白的表达量在本课题的前期研究中,以pPIC9为表达载体,在野生型或者蛋白酶缺陷型毕赤酵母宿主中实现了多种HSA融合蛋白的分泌表达,包括：HSA/GH. HSA/PTH (1-34)、 HSA/IL1Ra、 HSA/Thymosin al等等。但同时也发现,这些表达菌株的表达水平普遍较低(25-50mg/L),通过发酵条件优化对表达量的提升也较为有限。这一方面极大的限制了后期纯化蛋白的制备量与制备速度,制约了HSA融合蛋白的临床前研究进程；另一方面也增加了HSA融合蛋白前期开发投入以及后续产业化生产的成本。因此,构建HSA融合蛋白的高表达工程菌株显得尤为重要。本文考察了HSA融合基因拷贝数以及几种重要的分子伴侣共表达对HSA融合蛋白表达量的影响。结果表明,通过两种方式的结合可以使HSA融合蛋白在野生型毕赤酵母中的表达量大幅度提高,如HSA-G,-GH经过优化后的表达量在摇瓶水平从低于50mg/L提高到了364mg/L。该方法也可用于蛋白酶缺陷型宿主,如优化后的HSA/PTH (1-34)在GS115pep4△ypsl△中的表达量也有了显著提高,为一系列HSA融合蛋白的高表达工程菌株的构建奠定了基础。