细菌是医药和农药的重要来源。近年来,细菌的基因组测序工程揭示了有大量的天然产物合成途径未被发掘,对这些未知产物的途径的开发有两种主要的方式:原位激活和异源表达。在天然产物生产者的染色体上进行启动子插入等基因操作是原位激活的主要策略,然而至今大多数天然产物的生产者仍缺乏简捷高效的遗传工具来迎接基因组发掘的后基因组时代。以同源重组为基础的分子生物学技术是基因组工程的重要技术,Red/ET同源重组技术是一种首先在大肠杆菌中发现并被使用的,能够在体内通过短的同源臂(～50 bp)实现对基因改造的遗传操作手段。大肠杆菌的Red/ET重组酶系统可以对沙门氏菌(Salmonella enterica)、土壤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens 等革兰氏阴性菌进行基因修饰,但对于很多亲缘关系较远的菌类该系统的功能则受到限制。伯克氏菌目属于细菌中变形菌门的β-变形菌纲,被发现能够存在于水和土壤等多种生态环境中,包括具有致病性的一属和环境友好型的一属。据统计,伯克氏菌能够分泌包括各种具有蛋白水解活性和溶血活性的胞外酶在内的多种次级代谢产物。伯克氏菌中聚酮合酶途径和非核糖体多肽途径的总量只低于放线菌,伯克氏菌目前成为继放线菌之后的天然产物来源的第二大类细菌,然而其中大部分生物合成基因簇为未开发或者沉默的,想要对这些未知基因簇加以开发和利用,则必须借助有效的基因操作工具和表达宿主实现未知基因簇的原位激活和异源表达。来自大肠杆菌的Red/ET重组酶系统可以对泰国伯克氏菌(Burkholderia thailandensis)和类鼻疽伯克氏菌(B.pseudomallei 进行基因组序列的敲除和亚克隆等操作,但是在其他非自然转化的伯克氏菌中不能工作。因此开发具有普适性的基因操作工具和构建通用底盘菌对于源于伯克氏菌的天然产物的发现和获得是十分必要的。简单高效的伯克氏菌重组酶系统的建立以及工作条件的优化。本课题通过NCBI的BLASTP或DELTA-BLAST在约1000株伯克氏菌中找到了7对Redαβ类型和10对RecET类型的重组酶,本课题选择了存在于DSM7029中的一对Redαβ类重组酶蛋白(Redαβ7029)和Burkholderia sp.BDU8中的RecET类型的重组酶蛋白(RecETBDU)作为研究对象。经过一系列的功能验证,本课题选择Redαβ37029结合E.coli的核酸外切酶限制因子Redγ构建了一套能够在非自然转化的的伯克氏菌中工作的同源重组系统Redy-Redαβ 7029,并对这套系统的工作条件进行了优化,在优化后的工作条件下,该系统能够利用50 bp的同源臂实现DSM 7029基因组上200 k bp片段的敲除。Redγ-Redβ7029还能够非常高效的介导单链重组,尤其是在介导与滞后链序列互补的单链DNA为底物的同源重组时,重组效率是Redγ-Redαβ7029在最优条件下介导双链DNA重组效率的13倍。伯克氏菌DSM 7029中基因组无痕修饰方法的建立。本课题通过构建由DSM 7029pheS*突变基因和庆大霉素抗性基因(genta)构成的正反向筛选标记基因盒genta-7029 phS*实现对伯克氏菌DSM 7029基因组上的glidobactin合成基因簇进行了敲除,得到DSM 7029的无痕修饰突变株DSM7029Δglb。利用Redγ-Redαβ 7029系统进行未知基因簇的原位激活发现新的化合物。利用Redy-Redαβ 7029系统对伯克氏菌DSM 7029Δglb基因组上的未知基因簇BGC6A进行基因簇敲除和组成型启动子(Papra)的插入,确定了 BGC6A的激活产物。对BGC6A的产物进行分离纯化,结构鉴定以及活性测定确定其具有抗肿瘤活性,生防活性以及抗菌活性,将其命名为glidopeptinA。利用 Redγ-Redαβ7029对Burkholderia phytofirmans sp PsJN 进行基因组挖掘。利用 Redγ-Redαβ 7029 系统对Burkholderia hytofirmans sp PsJN 基因组上通过antiSMASH分析预测到的的天然产物生物合成基因簇进行基因簇敲除和组成型启动子(Papra)的插入的操作,进行化合物的发掘,实验结果表明,该系统能够成功的在Burkholderia phytofirmans sp PsJN 体内完成基因修饰。位点特异性重组酶(SSRs)是一类能够通过识别各自特定的、典型的回文序列对DNA进行结合、剪切和链交换的DNA修饰酶。最常使用的位点特异性重组酶同属于酪氨酸位点特异性重组酶蛋白家族(T-SSRs)。位点特异性重组酶的识别位点的长度范围为30 bp-200 bp,识别位点一般由两端对称的绑定位点区和中间不对称的间隔区组成,其中绑定位点负责重组酶的识别和绑定,间隔区序列决定了识别位点的方向并且是重组发生的区域。Dre位点特异性重组酶来自病原性沙门氏菌(Salmonella oranienburg)的转导噬菌体D6,该酶能够特异性地识别位于染色体上或者是质粒上特定的由32个碱基构成的位点—rox,以往的报道中称rox位点包括两端14碱基长的绑定位点和中间4个碱基的间隔区序列,回文序列负责Dre的结合,4个碱基的不对称序列决定了该rox位点的方向,并且是重组发生的场所。Cre、Flp和Dre对DSM7029毒害作用的验证。过去文献中报道因为哺乳动物基因组中常常存在一些神秘的位点,这些位点能够被Cre位点特异重组酶识别并引发基因组中一些不可预测的基因的丢失和颠倒。为了验证Cre、Flp和Dre对原核细胞是否也具有毒害作用,我们通过对分别带有这三种重组酶表达质粒的E.coli进行了生长曲线的测定,确定了 Cre和Flp的存在均对E.coli能够达到的最大生物量具有一定的影响,而Dre特异性重组酶的存在则对E.coli的生长则不具有明显的影响D6位点特异性DNA重组酶(Dre)的识别位点rox的间隔区序列的确定和功能的探索。本文中我们首次确定了 D6位点特异性DNA重组酶(Dre)的识别位点rox的间隔区序列包括8个碱基而非之前报道中的4个碱基,并且初步确定了 rox位点间隔区序列中每个碱基的功能。rox突变位点的建立以及特异性良好、重组效率高的rox突变位点的筛选与应用。通过点突变的方法构建了一系列的rox突变位点并从中筛选到了 6个重组效率较高,特异性良好的突变rox位点。经过翻转锁定实验(FLEx)验证筛选出的突变位点rox2131能够高效的介导重组并且具有良好的严谨性。