Midkine是一种肝素结合性生长因子,属于Midkine家族。Midkine家族由2个因子组成,即中肾因子(midkine, MK)和多效营养因子(pleiotrophin, PTN)。MK在胚胎期广泛表达,在成年组织中的表达则仅限于肾脏和小肠上皮。近年的研究发现MK在恶性肿瘤组织中有异常的高表达,这种现象没有组织特异性,这与P53突变体非常相似。MK有多种生物学功能,在胚胎期它能促进正常细胞的生长和分化,尤其可促进神经细胞的发育,在成年期有激发某些细胞分化的激素样作用,维持肾脏的正常功能。另外它还与肿瘤细胞的发生、增殖与分化有密切的关系,目前被认为是多种肿瘤癌症治疗中颇具前景的分子靶点。一些研究已经表明成体中MK表达量的变化与肿瘤发生和癌变进程有关。然而,有关MK在这些病变中的时空表达和组织学方面的信息,却基本是个空白。为此我们(一)首先使用免疫组化的方法研究MK在成人胰腺肿瘤和癌症组织中的表达情况。我们发现在免疫组化的图片中,MK的一些分子活性被很形像地描述了出来:(1)在病理组织中,MK有很高的表达;(2)在胰岛瘤(insulinoma)中,随着肿瘤的发展MK在肿瘤组织的边缘部分有很高的表达,但在肿瘤中表达量却较低;(3)在导管腺癌(ductal carcinoma)中,MK在入侵的血管,异常胰岛及其导管中都有高表达;(4)在后期的肿瘤组织中,在扩张的导管上皮中的快速分化细胞中MK表达很高。另外MK在损伤的胰腺中也经常有表达。这样看来MK似乎在肿瘤的生成和恶化过程中,扮演一定的角色:在胰岛瘤的生成过程中,它可能有转化细胞(变成胰岛素表达)及调控细胞(即胰岛素表达异常细胞的)迁移等方面的作用。而在导管腺癌的恶化(侵入,转移)中,我们可以比较直观的看出MK可能的扮演血管因子及增殖,抗凋亡的角色,既在促肿瘤恶化时增加血管密度和促进内皮增生,这对癌症的恶化有重要作用。(二)然后,为了检测MK在不同人类肿瘤/癌症中的表达情况,我们使用了RT-PCR的方法。实验选取的材料分别是人肺癌细胞系A549,人胃腺癌SGC-7901细胞,人卵巢癌细胞系8910,人成骨肉瘤细胞系MG-63这几种较为常见的癌细胞系以及病人手术割弃的肝癌,肾癌,乳腺癌,直肠癌组织。为了提高PCR反应的灵敏度和专一性,我们采用了巢式(Nested)、直降(Touchdown)PCR的方法。结果,(1)我们不仅确认了先前的一些发现,即MK在癌细胞系及其恶性肿瘤组织中都有很高的表达,(2)而且MK的截短型(truncated, tMK)在癌细胞系恶性肿瘤组织中达到100%的检出率(先前的检出率仅60%左右)。已有不少研究表明,tMK是一种缺少外显子III编码的N结构域及其周围序列的MK变异体,具有肿瘤特异性。tMK被普遍认为参与肿瘤的发生和发展,并因其在人类组织中的表达仅限于癌症组织而被认为可以作为检测癌症的一种有效的标志。因此,我们的实验中这种简单易行的方法,大大提高了tMK成为一个有效可行的癌症临床诊断标志物的可行性;(3)在肝癌手术的癌旁组织中发现有MK的高表达和tMK的表达,这与免疫组化的结果一样都证明了MK在癌症的发生、转移和侵入中起到了重要的作用,因此MK及其tMK具有可开发为癌症的早期检测标志物的可能性,这对于癌症肿瘤的有效检测与治疗都是非常有利的;(4)随后,用同样的技术,由于灵敏度和专一性的提高,我们首次发现了在人癌症组织及其癌细胞中,MK的另外两种新截短型,分别称tMKB和tMKC。之前己经发现并报道过的这种截短型称tMKA。它们的mRNA大小顺序是:tMKA > tMKB > tMKC。值得一提的是,之前在小鼠胚胎中也发现MK的三种截短型,其剪切形式与本文中的三种人类tMK十分相似;而疾病中的tMK又有明显变异。这可能为研究MK在病变中的功能,提供重要线索;(5)一个显著的特点是,这些tMK的剪切位点序列具有特异性,3’和5’端剪切位点碱基序列完全相同,如3’和5’端剪切位点序列都为-ACCCCC-。有趣的是这与之前在小鼠胚胎中发现的3种新的tMK是类似的剪切模式,也是具有此类序列专一性的mRNA剪切模式:这提示着,可能存在一种新型的mRNA剪切模式;(6)从基因结构上比较,tMKA缺失了整个外显子III,tMKB缺失了整个外显子III和IV的一部分,tMKC缺失了外显子III和IV的各一部分。对比之前在小鼠胚胎中也发现的三种tMK,可能为挖掘MK在正常发育和病变中的分子机制,提供新思路;(7)最后,我们运用实时定量(Real Time)PCR的方法,发现MK及tMK的表达量与肿瘤/癌症发生在量上的相关性,即MK,tMK在正常,病变前期和疾病组织中表达量的相关性:不仅进一步确证了,MK表达与疾病的关系,并为将来从量上,可能把MK、tMK表达量的检测用于临床上诊断疾病的严重程度,提供有利的数据。总结这方面的研究,我们不仅优化检测技术,使之更加灵敏,从而可能使这种技术成为一种潜在有效的临床检测癌症的方法,并可能在癌症的早期检测中发挥作用。而且首次发现了三种截短型MK在癌症中的特异表达。这些对研究MK在恶性肿瘤组织发生发展中的功能和分子机理,提供了新线索。为这方面的深入研究奠定了基础。