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目的:肾细胞癌(Renal cell carcinoma,RCC)简称肾癌,是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一。肾癌起病隐匿,早期无典型的临床症状且表现形式多样,导致诊断率低下。肾癌对传统的放疗和化疗均不敏感,尽管一些靶向治疗改善了肾癌患者的总体存活率,但是肾癌的预后仍不理想。因此,阐明肾癌进展的分子机制,对于发现新的预后标志物并开发新的靶向治疗药物有重要的意义。Y-盒结合蛋白1(Y-box binding protein 1,YBX1)是能够特异性结合目的基因启动子和增强子内部Y-box序列(CTGATTGGCCAA)的一类转录因子,能调节目的基因的转录和翻译。研究证实YBX1在乳腺癌、前列腺癌、鼻咽癌和肺癌等多种肿瘤中异常表达,且与肿瘤的预后相关。我们利用STRING数据库预测YBX1与Ras-GTP酶激活蛋白SH3结构域结合蛋白1(Ras-GTPase activating protein SH3domain binding proteins 1,G3BP1)可能存在相互作用。G3BP1是一种表达广泛、分子量为68 k Da的胞质蛋白,是通过免疫共沉淀分离得到的第一个Ras-GAP SH3结构域特异性结合蛋白,参与Ras下游信号通路。本研究将阐明YBX1与G3BP1相互作用通过分泌型磷酸糖蛋白1(Secreted phosphoprotein 1,SPP1)激活NF-κB信号通路的分子机制,解析YBX1与G3BP1蛋白在调控肾癌进展中的新功能与相关机理,为进一步研究肾癌治疗的药物抵抗,探索肾癌预后标志物及靶向抗肿瘤药物靶点提供实验理论依据。方法:1.以ACHN和A498肾癌细胞通过慢病毒介导的RNA干扰技术构建YBX1降表达的稳定细胞系,real-time PCR和western blot验证其m RNA和蛋白水平的变化。通过黏附实验、Transwell迁移实验和Matrigel侵袭实验分别检测YBX1降表达后对肾癌细胞ACHN和A498黏附、迁移和侵袭能力的影响。2.通过real-time PCR和western blot检测YBX1降表达后对G3BP1 m RNA和蛋白水平的影响,以及G3BP1降表达后对YBX1 m RNA和蛋白水平的影响。通过STRING在线数据库预测YBX1与G3BP1的相互作用。免疫共沉淀检测YBX1与G3BP1的相互作用,以及YBX1的不同结构域与G3BP1的结合位点。通过免疫荧光激光共聚焦显微镜检测YBX1与G3BP1在肾癌细胞中的定位情况。3.通过基因芯片筛选YBX1降表达后差异表达的基因,real-time PCR和western blot验证YBX1或G3BP1降表达后差异表达基因的m RNA和蛋白水平的变化。双荧光素酶报告基因检测YBX1或G3BP1对NF-κB转录活性的影响。通过western blot检测YBX1或G3BP1降表达后,对NF-κB亚单位p65以及p-p65(丝氨酸536)变化的影响。通过western blot检测SPP1降表达对YBX1或G3BP1诱导的NF-κB的表达及磷酸化的影响4.通过细胞迁移实验和Matrigel侵袭实验检测SPP1降表达对YBX1或G3BP1诱导的肾癌细胞迁移和侵袭能力的影响。5.通过western blot和免疫组化检测YBX1、G3BP1和SPP1在肾癌组织和癌旁组织中的表达情况,统计学分析YBX1的表达与G3BP1及SPP1表达的相关性。6.构建小鼠肾包膜下移植瘤模型,通过小动物活体成像观察原发肿瘤及肝、肺转移灶的荧光强度。通过HE染色检测肝、肺转移灶。免疫组化检测G3BP1降表达对YBX1和SPP1表达水平的影响。免疫荧光检测YBX1与G3BP1在小鼠移植瘤组织切片中的定位情况。结果:1.通过慢病毒介导的RNA干扰技术成功构建YBX1降表达的稳定肾癌细胞系ACHN-sh YBX1/Scr和A498-sh YBX1/Scr,real-time PCR和western blot检测YBX1的m RNA(***P<0.001)和蛋白水平均显著下调。与对照组相比较,YBX1降表达后肾癌细胞ACHN和A498的黏附能力、迁移能力和侵袭能力均明显降低(***P<0.001)。2.在肾癌细胞中YBX1降表达后G3BP1的m RNA和蛋白水平未见明显变化;同时,G3BP1降表达不影响YBX1的m RNA和蛋白水平,但YBX1的磷酸化水平降低。通过STRING数据库预测YBX1与G3BP1有相互作用。免疫共沉淀进一步证实G3BP1是YBX1的结合蛋白。同时,发现YBX1的130-205氨基酸结构域与G3BP1相互作用。免疫荧光激光共聚焦显微镜发现YBX1与G3BP1在肾癌细胞的胞质中有共定位。3.通过基因芯片检测分析,筛选差异表达基因并进行验证,发现YBX1降表达后SPP1的m RNA(***P<0.001)和蛋白水平均显著下调。与此同时,G3BP1降表达后,SPP1的m RNA(***P<0.001)和蛋白水平也降低。YBX1(***P<0.001)或G3BP1(*P<0.05)降表达后,NF-κB的转录活性下调。与对照组相比较,YBX1或G3BP1降表达后p65及p-p65的蛋白表达水平下调。SPP1降表达后显著抑制YBX1或G3BP1对NF-κB信号通路的激活。4.SPP1降表达后显著抑制YBX1或G3BP1对肾癌细胞迁移和侵袭能力的促进作用(*P<0.05)。5.与对应的癌旁组织比较,YBX1、G3BP1和SPP1在肾癌组织中表达升高(*P<0.05),并且YBX1的表达与G3BP1和SPP1的表达显著相关(**P<0.01)。6.G3BP1降表达后,裸鼠原发肿瘤及肝、肺转移灶的荧光强度降低。HE染色显示肝、肺转移灶的数目显著减少(**P<0.01)。免疫组化发现,G3BP1降表达组YBX1的表达水平不变,而SPP1的表达水平降低。免疫荧光显示YBX1和G3BP1在裸鼠移植瘤模型的组织切片细胞中有共定位。结论:1.YBX1降表达抑制肾癌细胞的黏附能力、迁移能力和侵袭能力。2.在肾癌细胞中,YBX1与G3BP1相互作用通过调控SPP1激活下游的NF-κB信号通路。3.与对应的癌旁组织相比较,YBX1、G3BP1和SPP1在肾癌组织中表达升高,且YBX1的表达与G3BP1和SPP1的表达显著正相关。4.在肾癌裸鼠移植瘤模型中,YBX1与G3BP1定位在细胞质中,G3BP1降表达通过YBX1/G3BP1–SPP1信号通路调控肾癌的转移。