B7-H4是免疫共刺激分子B7家族的成员，也是目前已知的免疫检查点，迄今为止在许多不同类型的人类肿瘤组织中发现了B7-H4，在肿瘤相关巨噬细胞和肿瘤浸润血管内皮细胞上B7-H4 也异常表达。B7-H4在肿瘤中的广泛表达以及对T细胞的抑制作用预示着它也有成为肿瘤免疫治疗的有效靶点的潜在可能。B7家族的另一著名成员PD-L1已被许多研究证实受EGFR信号通路的调控。然而，目前对于调控B7-H4表达的信号通路研究还很少。本实验室之前已证实EGF的刺激可上调人肺癌细胞中B7-H4的表达。肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因之一。非小细胞肺癌（NSCLC）占所有肺癌的85%，在非小细胞肺癌（NSCLC）的所有组织学亚型中都可以发现EGFR突变，目前使用小分子EGFR酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKIs）阻断EGFR通路已被作为一种有效的NSCLC治疗策略。　　本课题在前期证实了EGF的刺激可诱导人肺癌细胞A549,SPC-A-1中B7-H4表达上调的工作基础上，进一步在Lewis鼠肺癌细胞中也验证了EGF可诱导B7-H4的上调表达。在此基础上，为进一步验证EGFR信号通路可调控B7-H4的表达，我们使用了EGF与EGFR-TKIs(Gefitinib和Erlotinib)联合作用于细胞，在细胞水平证明了EGFR-TKIS可有效阻断EGF诱导的B7-H4上调表达。随后，我们将Lewis小鼠肺癌细胞皮下接种至C57BL/6小鼠体内，进一步研究EGFR-TKIs在体内对负性免疫共刺激分子PD-L1和B7-H4表达水平的影响。我们将小鼠按给药时间分为四组：7天，14天，21天，28天。每一个时间段的小鼠再按给药分为三组：对照组，Gefitinib组和Erlotinib组。研究结果表明，在给药7天时，Gefitinib和Erlotinib均能抑制B7-H4和PD-L1的表达，且EGFR信号通路下游分子AKT和ERK1/2的磷酸化水平也同样被抑制，给药14天时B7-H4和PD-L1的表达水平已恢复至与对照组无差别，至21天和28天时Erlotinib给药组PD-L1和B7-H4的表达水平显著高于对照组，而Gefitinib组 PD-L1的表达水平显著高于对照组，同时对信号通路分子活化水平的研究显示，Akt和ERK1/2的磷酸化水平在给药28天，也已经反弹高于对照组。同时，在检测肿瘤生长抑制率时，也发现在给药7天和14天时，肿瘤生长可显著被抑制，但是到给药 28 天时，Erlotinib 组肿瘤生长已没有明显抑制作用。这些结果显示，由于EGFR-TKIS丧失了对EGFR下游信号通路的抑制作用而导致失去对肿瘤增殖的抑制作用。小鼠体内结果证明，对待野生型EGFR的肺癌，EGFR-TKIS在用药初期，是可以阻断EGFR的信号通路的，但是伴随着用药时间的延长，肿瘤对药物产生耐药性，导致治疗的失败。同时，伴随着 EGFR-TKIS 耐药性的产生，负性免疫共刺激分子B7-H4和PD-L1的表达也有反弹。这以结果预示着EGFR-TKIS耐药性的产生可能也会影响肿瘤免疫逃逸，针对免疫检查点的靶向治疗可能对这类耐药病人有效。我们的研究为临床上制定EGFR-TKIS耐药病人的治疗提供新的治疗靶点和思路。　　本论文主要包括以下两部分内容：　　一、细胞水平研究EGFR-TKIS对肿瘤细胞中B7-H4表达水平的影响　　【目的】EGFR-TKIS是否可以影响B7-H4的表达水平　　【方法】EGF作用于Lewis小鼠肺癌细胞24小时后，提取总蛋白，western blot检测B7-H4蛋白表达。EGFR-TKIs(Erlotinib,Gefitinb)处理Lewis小鼠肺癌细胞24小时后，提取总蛋白，western blot检测B7-H4蛋白表达。EGF与Gefitinb联合作用于A549、SPC-A-1、Lewis小鼠肺癌细胞,提取总蛋白，western blot检测B7-H4蛋白表达。　　【结果】在Lewis小鼠肺癌细胞中，EGF可显著提高B7-H4的蛋白表达水平。EGFR-TKIs作用Lewis小鼠肺癌细胞后B7-H4 表达水平轻微下调。但EGF与Gefitinb联合作用细胞后，EGF诱导的B7-H4蛋白水平的上调作用被Gefitinib抑制。　　【结论】EGFR-TKIS可有效阻断EGF诱导的B7-H4上调表达。　　二、小鼠体内实验研究EGFR-TKIS对B7-H4表达水平的作用及对肿瘤微环境的影响　　【目的】EGFR-TKIS对小鼠肺癌模型B7-H4的表达水平和肿瘤免疫微环境的影响。　　【方法】Lewis小鼠肺癌细胞以皮下接瘤形式注入C57BL/6小鼠体内，老鼠被分成四组（给药时间分别为7、14、21和28天）。每组被分为三个亚组(对照组，Gefitinib组和Erlotinib组)。给药时间结束后将小鼠处死，Western Blot，免疫组化法，免疫荧光法检测组织蛋白中B7-H4及各信号通路分子表达变化情况，流式检测肿瘤组织巨噬细胞上B7-H4的表达变化情况。　　【结果】在给药7天时，Gefitinib和Erlotinib均能抑制B7-H4和PD-L1的表达，且EGFR信号通路下游分子AKT和ERK1/2的磷酸化水平也同样被抑制，给药14天时B7-H4和PD-L1的表达水平已恢复至与对照组无差别，至21天和28天时Erlotinib给药组PD-L1和B7-H4的表达水平显著高于对照组，而Gefitinib组PD-L1的表达水平显著高于对照组，同时对信号通路分子活化水平的研究显示，Akt和ERK1/2的磷酸化水平在给药28天，也已经反弹高于对照组。免疫组织化学和免疫荧光进一步证实了肿瘤标本中B7-H4、p-Akt 和p-ERK1/2的变化。肿瘤组织中巨噬细胞上，根据给药时长不同B7-H4表达变化情况与Western Blot显示的结果一致。同时，在检测肿瘤生长抑制率时，也发现在给药7天和14天时，肿瘤生长可显著被抑制，但是到给药28天时，Erlotinib组肿瘤生长已没有明显抑制作用。　　【结论】小鼠体内实验结果说明，针对野生型EGFR的肺癌，EGFR-TKIS在用药初期，是可以阻断EGFR的信号通路并对肿瘤的生长具有抑制作用的，但是伴随着用药时间的延长肿瘤产生耐药性，并伴随着PD-L1和B7-H4表达的上调及肿瘤免疫微环境的改变，导致治疗失败。