小鼠胚胎干(Embryonic stem, ES)细胞作为原始态全能性干细胞的典型代表,以其易于维持和分化培养,而成为ES细胞全能性和分化调节剂研究的理想模型。Rho GTP酶是细胞内重要的分子开关,对细胞骨架,增殖,细胞极性,基因表达等都发挥了重要调控作用。研究表明,RhoGTP酶相关通路在ES细胞存活和自我更新等方面也具有重要作用[14-16]。因此该类蛋白相关的抑制剂在ES细胞全能性和分化领域也可能有潜在的应用前景。目前针对Rho GTP酶的抑制剂大部分为间接抑制剂,即不与RhoGTP酶发生直接相互作用。本研究所用的抑制剂中,辛伐他汀(Simvastatin, SIM)可通过影响细胞脂代谢中间体的合成而影响异戊烯化介导的RhoGTP酶膜定位,从而发挥活性抑制作用。Y27632则为下游效应蛋白ROCK的特异性抑制剂。NSC23766是少数的直接抑制剂,它与Rac1结合,阻止其被Rho鸟苷酸交换因子(Rho guanine nucleotide exchang factor, Rho GEFs)激活；它们分别作用于RhoGTP酶信号通路的不同层面,发挥各自的作用。本论文通过小鼠ES细胞增殖和定向心肌分化模型,采用小分子抑制剂,探索了RhoGTP酶在这些过程中的作用,并围绕具有显著促分化作用的SIM和显著促增殖作用的Y27632,分别探讨它们在调控ES细胞全能性和心肌定向分化中的作用机制。同时为探索ES细胞自我更新调控中的新分子事件,进一步采用microRNA芯片及生物信息学方法对Y27632处理的细胞进行了相关研究和分析,以期发现调控自我更新信号新的线索。1.辛伐他汀促进小鼠胚胎干细胞心肌分化机制研究目的：利用小分子化合物探索RhoGTP酶在ES细胞心肌分化过程中的作用,并揭示相关机制。方法和结果：Western blotting方法检测小鼠ES细胞及定向心肌分化过程中RhoGTP酶蛋白表达发现,ES细胞和拟胚体(Embryoid bodies,EB)均表达RhoGTP酶家族三个主要成员：RhoA、Rac1和Cdc42。用ES细胞增殖和心肌分化模型分别对四个Rho GTP酶抑制剂进行作用研究。结果发现SIM可促进ES细胞心肌分化,NSC23766则可抑制心肌细胞分化,提示RhoA和Rac1在心肌分化过程中具有不同的作用。对SIM的促分化作用进行进一步研究发现,SIM0.1μM,1μM和5μM浓度可以剂量依赖性促进心肌搏动率增加和心肌特异性α-辅肌动蛋白(a-actinin)表达上调。综合考虑后选择1μM浓度进行后续实验。时效样本的检测发现,贴壁分化第4天开始,SIM组a-actinin表达显著上调,提示心肌细胞分化的加强。为确定SIM发挥促分化作用的时间窗,我们对分化前期(贴壁分化1-3天),后期(贴壁分化4-6天),及全程(贴壁分化1-6天)分别加药检测,发现全程加药的促分化作用最佳。免疫荧光检测发现SIM诱导的心肌细胞具有完整成熟的肌小节结构。对胞膜胞浆蛋白分离检测显示,SIM可以减少RhoA的膜结合,其下游蛋白MYPT1的磷酸化减弱,提示SIM减弱了RhoA相关信号转导。同时,蛋白免疫印迹检测到SIM组EB中粘着斑激酶(Focal adhesion kinase,FAK)磷酸化显著减弱。EB生长情况观察也发现SIM组EB外向生长明显减少,且该现象与a-actinin的表达变化密切相关。同时SIM诱导的EB中,Akt的308位点和473位点磷酸化均加强。结果提示SIM通过抑制EB中RhoA信号通路继而影响下游MYPT1, FAK和Akt磷酸化水平而促进ES细胞心肌分化。结论：EB生长过程中过度的RhoA信号转导不利于ES细胞定向心肌分化,SIM可以减弱EB中RhoA膜定位从而抑制MYPT1和FAK磷酸化,并加强Akt磷酸化而促进小鼠ES细胞向心肌分化。2.Y27632调控小鼠胚胎干细胞自我更新机制研究目的：通过Y27632探索ROCK与ES细胞自我更新调控的相关性和机制,并探索Y27632在ES细胞研究中可能的应用。方法与结果：细胞增殖实验发现Y27632具有显著促ES细胞增殖的作用。克隆形成实验显示Y27632能显著促进ES细胞克隆形成。传代实验表明,Y27632可以维持ES细胞在无饲养层和LIF的条件下稳定传代。为方便描述,将Y27632培养体系中培养一周以上的细胞定义为Y-ES细胞。对这些细胞进行全能性标志物的检测发现,Y-ES细胞克隆表达全能性标志物SSEA1和Oct4,且维持了较好的E-cadherin膜定位,EMT标志基因的表达较低或不表达,与常规培养ES细胞相似。基因水平的检测表明,Y-ES细胞的Oct4, nanog表达水平与ES细胞相似,但ES细胞特异性标志基因Rexl在Y-ES细胞中未检测到,提示此类细胞在全能性状态上有别于常规ES细胞。体内和体外分化实验表明,Y-ES细胞可以正常分化为神经细胞、心肌细胞和肝细胞。畸胎瘤测试也确证,Y-ES细胞可以在裸鼠体内分化形成具有三胚层组织结构的畸胎瘤。结果提示Y-ES细胞依然维持了较好的分化全能性。分子水平的检测发现,Y27632可以显著降低引起细胞分化的ERK1/2磷酸化水平。同时,Y-ES细胞中STAT3磷酸化水平显著低于ES细胞,表明Y27632诱导的细胞自我更新为非LIF依赖性自我更新。TGFβ受体抑制剂SB431542可诱导Y-ES细胞全能性标记的丢失,提示TGFβ通路在Y-ES细胞自我更新过程中发挥了作用。MicroRNA (miRNA)芯片检测到27条在Y-ES细胞与ES细胞之间差异表达的miRNA,这些差异miRNA与文献报道ES细胞与外胚层干(Epiblast stem, epiS)细胞之间的差异miRNA重叠较少,提示Y-ES细胞可能处于原始态和始发态全能性的中间状态。同时,miRNA数据还显示全能性相关的miR-302b-5p、 miR-295-5p在Y-ES细胞中得到较好的维持,抑制细胞全能性的miR-34b-5p在Y-ES细胞中显著下调,提示Y27632的维持全能性作用可能与miRNA调控网络相关。结论：抑制ROCK活性有利于维持ES细胞自我更新,其调控作用与抑制EMT发生,抑制ERK激活并影响miRNA表达谱相关。同时Y27632可替代抗性饲养层培养体系,作为小鼠ES细胞稳定转染细胞系筛选培养方法,简化了筛选培养过程。3.Y27632调控小鼠胚胎干细胞自我更新的miRNA芯片数据分析目的：更全面地了解YES细胞体系与常规ES细胞的差异,并从中提取更多的转录后调控分子信息,以期发现新的全能性相关分子事件。结果：将本研究发现的Y-ES细胞与ES细胞的差异表达miRNA与文献报道的ES细胞与epiS细胞的miRNA差异表达谱进行比对发现,两组差异表达谱重叠较少,在27条差异表达miRNA中仅有5条与之相同,提示Y-ES细胞处于不同于原始态全能性和始发态全能性的中间状态。对Y-ES细胞中上调的miRNA进行功能分析发现,8条常规分子通路可能受到潜在调控,其中包括粘着斑信号,Wnt信号通路和ErbB信号通路等。继而,对Y-ES细胞,ES细胞和EB的差异表达miRNA进行的分类比对分析发现,6条miRNA在Y-ES细胞和ES细胞维持高表达而在分化的EB样本中显著下调,另外16条miRNA在Y-ES细胞和ES细胞中低表达而在EB中高表达。这些miRNA作为全能性和分化相关的靶点,用定量RT-PCR进行表达验证,确定了全能性样本中高表达的5条miRNA及分化样本高表达的3条miRNA具有超过两倍的差异。对两组miRNA进行功能分析,分别发现13条和5条常规分子信号通路可能受到这些miRNA调控的信号通路,其中粘着斑(Focaladhesion)和ErbB信号通路具有较大相关性和研究价值。采用蛋白相互作用数据库分别对这两条通路与全能性核心转录因子网络进行相互作用预测,选取预测的关节节点进行蛋白表达验证,结果发现Y27632抑制了β-GSK3和β-ERK水平,维持了β-catenin的表达,并上调了c-Myc表达,提示这些信号信号在Y27632维持ES细胞自我更新过程中具有重要作用。结论：Y-ES细胞可能处于与ES细胞及epiS细胞均不同的全能性状态。Y27632通过上调c-Myc作用参与ES细胞全能性调控网络；β-GSK3, p-ERK和β-catenin也可能参与了Y27632维持ES细胞自我更新的作用。