研究背景及目的：目前,前列腺癌在全球范围内仍然是个严峻的问题。2014年北美地区男性非皮肤性肿瘤中,前列腺癌依旧是发病率最高的肿瘤,死亡率仅次于肺癌。前列腺癌的自然病程个体差异很大,导致临床工作者难以准确地判断其预后。恶性程度高的病例即使被早期发现并及时地接受了根治性的治疗,也会在短期内出现生化复发或临床转移。这种类型的肿瘤除了在确诊后及时接受根治性的治疗,还必须在术后接受辅助性的化疗或放疗,并密切随访。然而,大部分病例属于“惰性”的前列腺癌,其特点是进展缓慢,甚至终生不发病。研究发现积极地治疗48个前列腺癌患者,只有1个人因此而避免死于该疾病,原因在于大部分前列腺癌的病程较长,患者死于心脑血管等并存疾病的几率高,此类型的前列腺癌即使不接收任何治疗,对预期寿命的影响也很小。近几十年,随着PSA筛选的普遍推广,过度干预低度恶性的病例成为目前前列腺癌的治疗过程中凸显的问题。根治性的治疗往往给患者的生活质量及身心带来沉重的负面影响,因而对低度恶性的病例应采取定期随访的方案,而不积极地干预它。另一方面,保守治疗可能会导致病情突然恶化而错过最佳的治疗时机,使患者产生焦虑,致使许多属于“惰性”肿瘤的患者不愿意接受保守治疗。因此,正确地判断前列腺癌的恶性程度及预后十分关键,决定前列腺癌的治疗方案是否合理。目前临床中判断前列腺癌恶性程度和预后主要依赖术前的指标(临床肿瘤分期、Gleason评分、血清PSA浓度)和术后的指标(肿瘤病理分期、Gleason评分、血清PSA浓度、切缘状态、淋巴结是否转移)。术后的指标相对术前的指标能更准确地评估前列腺癌的恶性程度及预后。这些指标被组合成不同的模型用于预测前列腺癌的预后,但是有研究表明即便是采用术后指标的组合,其预测前列腺癌预后的准确率也只有75%-85%。如果是接受保守治疗的患者,其准确率更低。因此,单纯依靠传统的临床病理指标不能精确地区分“惰性”和高度恶性的病例,我们迫切需要深入研究和探索介导前列腺癌进展和转移的分子生物学机制,如果能找到潜在的关键通路和分子,除了能协助传统的指标制定更合理的治疗方案,也能为前列腺癌的分子靶向治疗提供可靠的理论依据。近年来,小分子RNA (microRNAs, miRNAs)在各种肿瘤中的作用越来越受到关注。它是内源性的小分子单链的非编码RNA,由大约22个核苷酸构成,它们以碱基配对的方式与编码蛋白的mRNA的3’端非编码区(3’UTR)结合,通过抑制翻译起始和(或)降解mRNA的途径来抑制基因转录后的表达。niRNAs已被大量的研究证实了在肿瘤中表达失调,主要是通过直接调控下游编码蛋白的基因表达参与肿瘤的发生和进展。miRNAs调控了人类超过一半的编码蛋白的基因,并且它们的表达水平异常或者功能紊乱与肿瘤的发生和进展密切相关。目前已有许多研究明确了miRNAs在前列腺癌扮演重要的角色,如miR-34a、miR-373和miR-520c、因此,miRNAs是研究前列腺癌分子机制重要的组成部分及潜在的治疗靶点。众多miRNAs中,对于miR-15/107家族基因成员miR-195在肿瘤中作用的研究是近几年miRNAs领域的热点。miR-195已被证实了在多种恶性肿瘤中表达下调,并发挥关键的抑癌作用,包括乳腺癌、肝细胞癌、食管鳞癌和肾上腺皮质癌。这些研究结果证明了miR-195通过直接调控下游靶基因的表达从而参与调控肿瘤细胞周期、细胞凋亡、细胞迁移、细胞侵袭和血管生长等过程,从而发挥抑制肿瘤进展的作用。与miRNAs的生物学功能具有高度组织和细胞特异性的特点一致,在恶性黑色素瘤中,miR-195被发现通过调控WEE1能够促进黑色素癌细胞增殖、迁移和侵袭进而发挥促癌作用。目前,miR-195在前列腺癌中的表达情况和分子生物学功能尚不清楚。本研究旨在探索miR-195在前列腺癌中的作用及其调控的靶基因。材料：1.人临床组织来源：12对配对的原发性前列腺癌及癌旁良性冰冻前列腺组织从广州市第一人民医院组织库获得；Taylor数据库是一个公用的数据平台,其中miRNA表达谱芯片包含带有临床随访数据的113个原发性前列腺癌病例；人的前列腺组织芯片(Tissue microarrays, TMA)包含225例人原发性前列腺癌组织和25例癌旁良性前列腺组织,是1993年9月到1995年3月期间在美国麻省总医院(MGH)接受前列腺癌根治术的病例。2.动物：20只年龄在4-5周的BALB/c雄性裸鼠购买于广东医学实验动物中心。3.细胞株：3种前列腺癌细胞株(PC3/DU145/LNCaP)是2012年从美国马纳萨斯(Manassas, VA, USA)的American Type Culture Collection (ATCC)公司购买得到,而良性的前列腺上皮细胞系PrEC是从Lonza公司购买。方法：1.慢病毒载体稳定转染DU145和LNCaP构建miR-195过表达和抑制表达的细胞株；核酸或质粒瞬时转染DU145和LNCaP构建靶基因S6K1、miR-195和靶基因S6K1同时过表达等细胞株。2. Taylor公用数据库分析miR-195的表达水平与人前列腺癌的临床病理特征和预后的相关性。3.细胞功能实验分析miR-195在体外对前列腺癌细胞功能的影响,以及靶基因S6K1能否拮抗miR-195对前列腺癌细胞引起的效应,包括细胞增殖实验、凋亡实验、划痕实验、侵袭实验。裸鼠皮下接种DU145和LNCaP细胞株形成裸鼠皮下移植瘤模型,用于分析miR-195在体内对前列腺癌成瘤和转移方面的影响。4. iTRAQ技术对稳定过表达miR-195和空白对照的LNCaP细胞株进行质谱分析,探索由miR-195引起的差异表达的蛋白。结合IPA软件和GO功能分析差异蛋白所涉及的信号通路和分子生物学功能。5. miRNAs靶基因预测软件Target-Scan、miRWalk和miRanda同时预测受miR-195调控的靶基因；荧光素酶报告系统确认miR-195直接调控的靶基因。6. qRT-PCR检测miR-195过表达和空白对照的LNCaP细胞株中候选靶基因S6K1、SMAP2、DCUN1D1、SMAD4、IP091、CAPZA2和CPNE1的表达水平。qRT-PCR分别检测前列腺癌细胞株PC3、DU145和LNCaP,正常前列腺上皮细胞株PrEC,以及12对前列腺癌和对应的癌旁良性前列腺组织的miR-195和靶基因S6K1的表达水平。7. Western bolt检测miR-195异常表达的DU145和LNCaP细胞株以及裸鼠皮下移植瘤组织中靶基因S6K1的蛋白水平；Western bolt检测靶基因S6K1表达异常的相关细胞株构建是否成功；Western bolt检测miR-195过表达或S6K1被抑制表达的DU145和LNCaP细胞株中靶基因S6K1下游已被研究证实的潜在效应因子MMP-9、VEGF、BAD和E-cadherin的蛋白水平。8.免疫组织化学分析S6K1在包含225例人前列腺癌和25例癌旁良性前列腺癌的组织芯片的表达情况；免疫组织化学分析miR-195异常表达的DU145和LNCaP细胞株接种形成的裸鼠皮下肿瘤组织中CD31和Vimentin的表达情况。统计学处理：数据统计分析用SPSS 17.0统计软件包处理。连续变量以X±s的形式展示。计数资料采用皮尔森卡方检验。Kolmogorov-Smirnov (K-S)检验用于评估Taylor数据库中miR-195芯片值分布是否符合正态分布。qRT-PCR、免疫组化、Western blot和细胞功能实验等定量结果的统计学分析采用两独立样本t检验。两独立样本t检验和One-way ANOVA检验用于分析Taylor数据库中miR-195表达水平和前列腺癌患者临床病理特征之间的关系。LSD法用于两个以上分组的组间两两比较。重复测量方差分析分析不同时间点上两组数据之间的比较。配对t检验用于分析miR-195和S6K1各自在12对匹配的前列腺癌和癌旁良性组织中的mRNA水平的差异o Kaplan-Meier方法及log-rank检验用于生存分析,COX比例风险回归模型单因素和多因素分析评估miR-195和S6K1是否能作为预测前列腺癌预后的独立指标。Pearson相关性分析用于分析前列腺癌组织标本中miR-195和S6K1之间表达量的相关性。P<0.05为差异具有统计学意义。结果：1.相对正常前列腺上皮细胞株PrEC, miR-195在PC3、DU145和LNCaP细胞株中的表达量均显著性下调(P<0.001); miR-195在人临床前列腺癌组织中的表达量相对于癌旁良性前列腺组织的表达量同样显著性下调(P=0.020)。2.利用Taylor公用数据库分析显示miR-195的表达水平跟前列腺癌Gleason评分成显著性负相关(P=0.001), miR-195表达水平的下调与前列腺癌根治术后发生远处转移及生化复发密切相关(P=0.01,0.009),然而,miR-195的表达水平与患者的术前血清PSA浓度、肿瘤临床分期、肿瘤病理分期以及是否死亡不存在统计学意义的相关性。Kaplan-Meier和Log rank方法显示miR-195的表达水平与患者的总体生化复发率和无转移生化复发率存在显著性负相关(P=0.001,0.009),但与患者的总体生存率和无转移生存率不存在统计学意义的相关性(P=0.721,0.806)。COX比例风险回归模型单因素分析结果提示肿瘤病理分期、Gleason评分和miR-195的表达水平都是预测前列腺癌患者接受前列腺癌根治术后出现生化复发的重要指标,而年龄、术前血清PSA水平、肿瘤临床分期不能作为判断前列腺癌预后的预测因子。COX比例风险回归模型多因素分析结果提示miR-195表达水平[HR:0.58 (0.39-0.85)]、Gleason评分[HR：5.83(2.71-12.54)]和病理分期[2.71(1.09-6.71)]能够作为预测生化复发风险的独立指标。3.体外细胞功能实验显示miR-195过表达的DU145和LNCaP细胞株的增殖、迁移、侵袭能力相对空白对照组明显下降,而发生凋亡的比率明显增加。相反,miR-195抑制表达的DU145和LNCaP细胞株的增殖、迁移、侵袭能力相对对照组明显增加,而发生凋亡的比率明显降低(P<0.05)。4.裸鼠皮下移植瘤模型显示miR-195过表达能够显著性抑制由DU145和LNCaP形成的移植瘤的成瘤大小和生长速度(P<0.05)；相反,miR-195的表达被抑制后移植瘤成瘤大小比对照组大,且生长速度加快。免疫组化分析结果显示miR-195能够显著性抑制移植瘤组织中新生血管指标CD31和肿瘤侵袭力指标Vimentin的表达水平(P<0.05)。5. iTRAQ发现的差异性表达蛋白总共有3194个,其中有78个蛋白的差异表达倍数≤-1.5或≥1.5 (miR-195 vs miR-NC),包括28个上调蛋白和50个下调蛋白。IPA软件的KEGG通路分析显示大部分上调蛋白参与代谢类的通路,例如柠檬酸循环、缬氨酸降解、丙氨酸生物合成、辅酶生物合成和脂肪酸氧化。大部分下调的蛋白参与mTOR通路、IL-8通路、AMPK通路和IGF-1通路等肿瘤相关通路。GO功能会聚系统分析结果显示差异蛋白涉及的与肿瘤相关的生物学功能包括细胞周期、细胞侵袭、细胞形态变化和细胞运动。6.3个miRNAs靶基因软件共同预测50个下调蛋白中可能被miR-195调控的候选靶基因,结果显示SMAP2、DCUNID1、SMAD4、IP09、S6K1、CAPZA2和CPNE1为候选靶基因。qRT-PCR结果显示SMAP2、S6K1、IP09和DCUNIDI在miR-195过表达的LNCaP细胞株和裸鼠皮下移植瘤组织中表达下调(P<0.05)。荧光素酶报告系统进一步揭示S6K1是miR-195直接调控的靶基因(P<0.001)。qRT-PCR和western blot证实miR-195和S6K1在前列腺癌细胞株、移植瘤和人临床前列腺癌组织中的基因和蛋白表达水平均呈负相关的关系。7.体外细胞功能实验示S6K1过表达可以拮抗miR-195对前列腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用,以及减缓miR-195对细胞凋亡的促进作用(P<0.05)。另外,siRNA抑制S6K1的表达后在体外对前列腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡功能的影响与miR-195对前列腺癌细胞产生的效应一致(P<0.05)。这些结果进一步揭示了S6K1可能是miR-195发挥抑制前列腺癌进展作用下游重要的媒介。8.组织芯片免疫染色分析显示前列腺癌组织标本的S6K1阳性表达率[174/225(77.3%)]显著高于癌旁良性前列腺组织[10/25(40%)](χ2=16.140,P<0.001); S6K1的阳性表达与前列腺癌患者的病理分期较晚(χ2=4.396,P=0.036)、手术切缘阳性(χ3=5.371,P=0.02)、生化复发(χ2=5.696,P=0.017)和总体生存率降低(χ2=5.417,P=0.02)有关。Kaplan-Meier和Log rank方法分析结果显示S6K1的阳性表达跟患者总体无生化复发生存率和总体生存率降低有关(P=0.011,0.022),但与无转移生存率的降低不存在相关性(P=0.058)。COX比例风险回归模型显示S6K1可作为预测前列腺癌患者无生化复发生存率和总体生存率的独立指标,HR(95% CI)分别是2.041(1.098-3.792)和2.992(1.058-8.462)。9.在前列腺癌细胞株LNCaP和DU145中,抑制S6K1的表达或miR-195过表达均可以导致MMP-9和VEGF的蛋白水平下降,而E-cadherin和BAD的蛋白水平上调,这结果说明MMP-9、VEGF、E-cadherin和BAD是miR-195-S6K1轴下游的重要效应因子。结论：1.miR-195在前列腺癌中是一个重要的抑癌基因；miR-195通过负性调控S6K1的表达抑制人类前列腺癌的进展。2.miR-195和S6K1均可单独作为预测患者在接受前列腺癌根治术后出现生化复发风险的指标；S6K1还可单独作为预测前列腺癌患者总体生存时间长短的指标。总之,有望通过检测前列腺癌组织中miR-195和S6K1的表达水平,协助传统的临床病理指标更准确地区分低度恶性和高度恶性的前列腺癌,优化治疗方案。3. miR-195-S6K1信号轴进一步揭示了前列腺癌发生进展的分子机制,并有望成为治疗前列腺癌的新靶标。