应激首先由生理学家Selye提出,是指个体在受到内外界环境因素、社会因素及心理因素的刺激时表现出的全身性非特异性适应反应。适当强度的应激有助于机体增强抵御不利环境的能力,长时间大强度下的应激容易透支身体潜能,并诱发应激损伤。大脑是机体面对应激反应时最关键的器官,极易受到其负面影响,但其机制目前尚未明了。先前研究发现,高水平的Hcy可能是参与应激性认知障碍的致病因素之一。Hcy是蛋氨酸循环的重要中间产物,与机体甲基化进程密切相关,并且在DNA甲基化中发挥着及其重要的作用。近年来越来越多的研究发现,与神经功能密切相关的蛋白——BDNF可以通过甲基化修饰,进而影响部分精神疾病的发生发展。因此,本研究拟采用慢性不可预见性温和应激(CUMS)方法建立应激大鼠模型,并以BDNF为靶点,通过动物行为学实验、分子生物学实验以及组织形态学实验探讨Hcy介导的甲基化机制在大鼠慢性应激性认知功能障碍中的作用。为应激性认知障碍提供新的病理生理学机制,从而为发现治疗靶点提供新的思路。第一章血浆Hcy水平变化在大鼠应激性认知障碍中的作用目的:观察CUMS对大鼠认知功能的影响,探索血浆Hcy水平在大鼠应激性认知功能障碍的作用。方法:(1)动物模型:采用CUMS方法建立应激大鼠模型,并分别通过给予高蛋氨酸饮食和复合B族维生素灌胃来上调和下调血浆Hcy水平。(2)动物行为学检测:采用Open-field旷场实验检测大鼠自主探究行为,采用Morris水迷宫实验检测空间学习和记忆能力,采用电跳台实验检测对被动回避学习记忆能力,采用物体识别实验检测对新事物探究能力。(3)血浆Hcy水平检测:采用高效液相色谱(HPLC)分析方法检测。结果:持续的CUMS可导致大鼠各项认知功能出现下降趋势,自应激干预第6周起,上述各项功能均显著性下降(p<0.05)。与此同时,持续的CUMS还可导致大鼠血浆Hcy水平出现上升趋势,并且自应激干预第4周起呈现出显著性差异(p<0.05)。相关性分析显示大鼠血浆Hcy水平与其认知指数、被动回避学习记忆能力及空间学习记忆能力均呈现负相关关系。此外,通过给予高蛋氨酸饮食上调Hcy水平可诱导出与CUMS大鼠相类似的认知功能障碍,而在应激基础之上下调Hcy水平可以翻转应激导致的认知功能障碍。结论:(1)慢性应激可以诱导大鼠出现认知功能障碍。(2)慢性应激可以导致大鼠血浆Hcy水平升高。(3)血浆Hcy水平升高是大鼠应激性认知障碍发生的原因之一。第二章Hcy调控应激大鼠认知功能的机制目的:观察CUMS对大鼠血浆甲基化潜能(SAM/SAH值)、甲基转移酶表达、bdnf启动子甲基化水平以及BDNF蛋白表达的影响,并研究向CUMS大鼠海马转染高表达TET1的腺相关病毒(AAV—TET1)对BDNF蛋白表达及大鼠行为学的影响,探索血浆Hcy通过甲基化途径影响认知功能的机制。方法:(1)动物模型:除与第一章相同的动物模型外,另采用向CUMS大鼠海马转染AAV—TET1的方式诱导海马DNA脱甲基化。(2)动物行为学检测:同第一章。(3)血浆Hcy水平检测:同第一章。(4)血浆甲基化潜能检测:采用酶标记免疫吸附测定实验法(ELISA)检测。(5)海马甲基转移酶DNMT1、DNMT3b检测:采用蛋白免疫印迹实验法(WB)检测。(6)海马BDNF蛋白表达检测:采用WB及免疫荧光实验法(IF)共同检测。(7)海马bdnf启动子甲基化水平检测:采用甲基特异性聚合酶链式反应法(MSP)检测。结果:8周CUMS干预可导致大鼠甲基化潜能出现降低趋势,通过高蛋氨酸饮食上调血浆Hcy水平可显著降低大鼠甲基化潜能(p<0.01),而在应激基础上下调血浆Hcy其甲基化潜能则未出现显著改变。与此同时,CUMS干预还可导致大鼠海马甲基转移酶DNMT1、DNMT3b表达显著升高(p<0.05),上调血浆Hcy水平也可显著升高海马DNMT1、DNMT3b的表达(p<0.05),而在应激基础上下调血浆Hcy水平,海马甲基转移酶DNMT1、DNMT3b并未出现显著改变。此外,8周CUMS可以显著升高海马bdnf启动子甲基化水平(p<0.05),同时显著降低BDNF蛋白表达(p<0.01),上调血浆Hcy水平可以出现与CUMS相同的效果,即海马bdnf启动子甲基化水平升高(p<0.05),且伴随BDNF蛋白表达降低(p<0.01);而在应激基础上下调血浆Hcy水平,则可以翻转应激所致的bdnf基因启动子高甲基化和蛋白表达下降。对CUMS大鼠转染AAV—TET1诱导DNA脱甲基化,可以显著上调海马BDNF蛋白的表达(p<0.01),并且显著提高大鼠认知功能。结论:(1)慢性应激可以通过血浆Hcy水平升高进而导致大鼠甲基化潜能下降、并增加海马甲基转移酶DNMT1、DNMT3b的表达。(2)慢性应激可以通过升高血浆Hcy水平,进而升高海马bdnf启动子甲基化水平,最终减少BDNF蛋白的表达。(3)对CUMS大鼠海马转染AAV—TET1可增加BDNF的表达。BDNF对大鼠自主探究能力、空间学习和记忆能力、被动回避学习记忆能力以及对新事物的探究能力具有促进作用。