论文部分内容阅读
目的肝细胞肝癌是目前全球主要的恶性肿瘤之一,尽管目前肝癌的诊断及治疗手段的进步已使更多患者获得了延长生命的机会,但是肝癌术后的复发转移仍严重影响着患者的预后。NEDD9是一种与实体肿瘤转移密切相关的细胞内支架蛋白。最近研究发现NEDD9在肝细胞肝癌标本中表达上调,但NEDD9在肝细胞肝癌中的具体作用仍未阐明。因而我们通过体内外实验,探索NEDD9在肝细胞肝癌侵袭转移方面的具体作用以及可能的潜在机制。方法在肝癌细胞株以及140对肝细胞肝癌标本中,采用qPCR、Western blot以及免疫组化等多种方式检测NEDD9的表达情况,并结合患者临床病理资料分析NEDD9与患者临床特征以及预后的相关性。分组分析非侵袭性肝癌以及侵袭性肝癌中NEDD9的表达差异。构建NEDD9敲减以及过表达细胞株,通过MTS细胞增殖实验Transwell细胞迁移及侵袭实验以及裸鼠体内脾脏注射-肝转移模型,观察NEDD9对肿瘤增殖、侵袭、转移能力的影响。运用qPCR、Western blot、免疫荧光、免疫组化等多种方法初步探究NEDD9在促进肝细胞肝癌侵袭转移方面的潜在机制。结果qPCR以及Western blot检测发现NEDD9在肝癌细胞株中的表达较正常肝细胞株中表达上调。140对肝细胞肝癌标本通过免疫组化检测发现NEDD9在肝细胞肝癌中表达升高,且与患者的血清AFP浓度(p=0.008)、肿瘤癌栓(p=0.005)和肿瘤TNM病理分期(p=0.014)有明显相关性。根据肝癌患者是否合并肿瘤癌栓将患者分成非侵袭性肝癌组以及侵袭性肝癌组,发现两组之间NEDD9表达存在差异。结合肝癌患者的随访数据,采用Kaplan-Meier生存分析发现NEDD9高表达者较低表达者有更短的无瘤生存期和总生存期,COX多因素回归分析提示NEDD9是肝癌术后复发的独立危险因素。成功构建NEDD9过表达慢病毒质粒,并在肝癌细胞株HCC-LM3和Huh7中成功构建NEDD9敲减以及过表达细胞株。MTS细胞增殖实验提示NEDD9敲减能明显抑制肝癌细胞的生长。Transwell细胞迁移及侵袭实验提示,NEDD9敲减能明显抑制肝癌细胞的迁移及侵袭能力,NEDD9过表达能增强肝癌细胞株的迁移及侵袭能力。裸鼠体内脾脏注射-肝转移模型发现,NEDD9过表达组裸鼠较对照组在肝脏表面形成更多的转移结节。机制方面,我们发现在肝癌细胞以及肝癌组织中,NEDD9能反向调控E-cadherin的表达,FAK参与了 NEDD9对E-cadherin表达的调控。结论NEDD9在肝癌细胞株及肝癌组织中均表达上调。NEDD9与肝癌临床的侵袭转移特性有一定的相关性。NEDD9能明显增强肝癌细胞的侵袭及转移能力。NEDD9能反向调控肝癌中E-cadherin的表达,可能是NEDD9促进肝癌侵袭转移的潜在机制。目的肝细胞肝癌术后复发严重影响着肝癌患者的预后,肿瘤标记物作为一种从分子生物学角度参与评估肿瘤患者预后的新方法也具有潜在的重要意义。DIXDC1是一种含有DIX结构域的支架蛋白,作为Wnt信号通路的正向调控因子参与神经系统的发育。尽管DIXDC1已经在某些恶性肿瘤中进行了研究,但是目前在肝细胞肝癌中尚无任何的相关报道,因而我们本次研究目的主要是探究DIXDC1在肝癌中的表达及其临床意义。方法通过生物信息学的方法从Oncomine数据库中检索关于DIXDC1在肝细胞肝癌中表达情况的数据。采用qPCR、Western blot等方法检测25对新鲜肝细胞肝癌标本中DIXDC1的表达情况。进一步在140对肝细胞肝癌标本中,通过免疫组化的方法评估DIXDC1的表达,并结合患者临床病理资料分析DIXDC1与患者临床病理特征以及预后的相关性。结果Oncomine数据库中三个独立的检测数据提示,肝细胞肝癌中DIXDC1的mRNA表达水平较正常肝组织表达下调。在25对新鲜肝细胞肝癌组织中,通过qPCR以及Western blot检测发现DIXDC1在大部分肝癌组织中表达下降。在140对肝细胞肝癌标本中,通过免疫组化评估发现DIXDC1在肝细胞肝癌中低表达,且与肿瘤大小(p=0.024)、肿瘤细胞分化程度(p<0.001)、肿瘤癌栓(p=0.019)、肿瘤TNM病理分期(p=0.019)及肝癌巴塞罗那临床分期(p=0.008)等患者疾病进展相关指标有密切关系。更重要的是,Kaplan-Meier生存分析发现DIXDC1低表达患者较高表达者有更短的无瘤生存期和总生存期,COX多因素回归分析提示DIXDC1是肝癌患者总生存期的独立预后因子。结论我们首次揭示DIXDC1在肝细胞肝癌中表达下调。低表达DIXDC1与患者的临床疾病进展状况以及较差的预后有明显相关性。DIXDC1可作为一个新的肿瘤标记物来预测肝细胞肝癌患者术后的临床转归情况。