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滞育是昆虫遇到低温、高温、干旱和食物短缺等不良环境,进入发育停滞等的一种生理现象,以此来保证昆虫种和个体的生存。葱蝇Delia antiqua是世界性范围内百合科植物的一种害虫,属于双翅目、花蝇科、地种蝇属,在遇到不同环境,蛹会进入夏滞育和冬滞育,是研究滞育机制的理想模式种。海藻糖作为昆虫的血糖,在昆虫正常生长发育和滞育发面起着很重要的作用,本研究通过对葱蝇海藻糖合成酶基因(trehalose-6-phosphate synthase, TPS)、海藻糖磷酸酶基因(trehalose-6-phosphate phosphatase,TPP)和海藻糖酶基因(trehalas, TRE)的克隆、序列特征及与滞育相关的表达分析,旨在证明个基因在海藻糖的合成和降解以及抵御高温和低温环境方面发挥重要作用,为进一步弄清葱蝇滞育分子机制提供理论依据。研究结果如下：①葱蝇海藻糖合成酶基因的克隆与分析根据葱蝇抑制消减杂交文库中的EST序列信息,设计特异性引物并通过RACE技术克隆了葱蝇海藻糖合成酶基因全长cDNA,命名为DaTPS1,其全长为2904bp,开放阅读框2448bp,编码815个氨基酸,推测其相对分子质量为91.2kD,等电点为5.96。分析表明该基因编码的氨基酸序列具有海藻糖合成酶家族的4个保守区蛋白序列和各个底物结合位点,以及两个保守结构域,与其他物种TPS具有较高的同源性,其中和黑腹果蝇Drosophila melanogaster亲缘关系最近,相似性为91.2%。用半定量PCR和实时荧光定量PCR对滞育期表达分析表明,TPS1在葱蝇非滞育、夏滞育和冬滞育期蛹中都有表达,但是非滞育期各时期表达量基本没有变化,而在夏滞育、冬滞育期前期表达较高,滞育保持期较低,滞育期后期又有所升高。推断在葱蝇夏滞育和冬滞育期前期,TPS1开始催化合成较多的海藻糖以提高滞育期抵御不良环境的能力,滞育保持期蛹的新陈代谢降低,所需能量较少,所以TPS1处于低表达状态,而滞育期结束后,蛹发育活动逐渐恢复,所需能量有所增加,TPS1再次抬高表达。②葱蝇海藻糖磷酸酶基因的克隆与分析根据本实验的葱蝇转录组中相关数据,克隆了葱蝇海藻糖磷酸酶基因全长cDNA,命名为DaTPP,其全长为共包含1414bp,其中编码区为822bp,编码273个氨基酸,推测其相对分子质量为30.7kD,等电点为5.77。分析表明该基因编码的氨基酸序列具有海藻糖磷酸酶家族的3个保守区蛋白序列和各个底物结合位点,以及一个保守结构域,与其他物种TPP具有较高的同源性,其中和拟果蝇Drosophila simulans亲缘关系最近,相似性为85.0%。用半定量PCR和实时荧光定量PCR对滞育期表达分析表明,TPP在葱蝇非滞育、夏滞育和冬滞育期蛹中都有表达,但是非滞育期各时期表达量基本没有变化,而在夏滞育、冬滞育期前期表达较高,滞育保持期较低,滞育期后期又有所升高。该基因与TPS1共同催化合成海藻糖,所以表达规律是相似的。③葱蝇海藻糖酶基因的克隆与分析根据本实验室葱蝇转录组相关数据,得到葱蝇海藻糖磷酸酶基因全长cDNA,命名为DaTRE,其全长为共包含2082bp,其中编码区为1788bp,编码595个氨基酸,推测其相对分子质量为68.6kD,等电点为5.19。分析表明该基因编码的氨基酸序列具有膜结合型海藻糖酶家族的两个标签蛋白序列和一个甘氨酸富集区,以及两个保守结构域,与其他物种TRE具有较高的同源性,其中和桔小实蝇Bactrocera dorsalis亲缘关系最近,相似性为78.7%。滞育期表达分析表明,DaTPP在葱蝇非滞育、夏滞育和冬滞育期蛹中都有表达,但是非滞育期各时期表达量基本没有变化,而在夏滞育、冬滞育期前期表达较高,滞育保持期较低,滞育期后期又有所升高。推断在夏滞育、冬滞育的滞育初期,TRE表达保持较高水平,有利于将体内过量的海藻糖转化成抗逆的碳水化合物进行贮存,进入滞育期后,TRE的表达下降,使滞育蛹维持较高水平的海藻糖,提高蛹对高、低温的抵抗能力,在滞育后期,TRE表达抬高,使海藻糖转化成了葡萄糖,从而有利于打破滞育.恢复生长发育。