论文部分内容阅读
针对软骨组织的特点,设计化学结构仿生化的支架,再将细胞生长因子和生物活性基团引入其中,以增强支架的生物活性。用含有配体RGD的生物大分子和多肽修饰合成高分子微球,使其能与细胞发生特异性结合,来促进细胞粘附和铺展。设计生物活性大分子梯度分布的表面与界面,来调控软骨细胞的粘附行为。这些工作对具有诱导细胞增殖和迁移的软骨组织工程活性支架的设计和制备有重要意义。选用天然生物大分子明胶、壳聚糖和透明质酸模拟天然软骨化学组成,以冻干法制备了三组分多孔支架,其中明胶、壳聚糖和透明质酸含量分别为82.6%,16.5%和0.9%。以碳化二亚胺(EDAC)为缩合剂,将肝素接枝固定于明胶/壳聚糖/透明质酸多孔支架表面,肝素接枝率可达到23%。通过对支架体外性能的对比研究,发现接枝肝素之后支架体外失重率降低,肝素在支架中能增加聚电解质分子之间的相互作用,稳定支架结构。在支架中加入碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),获得了复合有生长因子的活性多孔支架。体外软骨细胞培养结果表明,负载bFGF的肝素化明胶/壳聚糖/透明质酸多孔支架能提高细胞活性、促进细胞生长与功能表达。用细胞特异性配体分子对壳聚糖改性。以NaBH3CN为催化还原剂,将乳糖接枝到壳聚糖分子上,制备了含有β-半乳糖基结构的壳聚糖-g-乳糖(Chitosan-g-lactose)。采用FTIR和1HNMR证明了乳糖在壳聚糖分子上的接枝,测得壳聚糖氨基接枝率为66%。壳聚糖-g-乳糖膜的溶胀比和体外失重速率均很大,但和肝素共混之后,由于分子间的静电作用,使溶胀比和体外失重明显下降。体外细胞培养结果表明,壳聚糖-g-乳糖的细胞相容性显著优于壳聚糖;和肝素结合后,进一步促进了软骨细胞的粘附、增殖和基质分泌。采用冻干法制备了明胶/壳聚糖-g-乳糖/透明质酸多孔支架,该支架比前文的三组分支架具有更强的促进软骨细胞增殖和基质分泌的能力。设计了将力学性能较好的PLGA微球与天然高分子复合,制备天然/合成复合支架。将PLGA微球和明胶/壳聚糖/透明质酸溶液混合,采用冻干法制备了PLGA/明胶/壳聚糖/透明质酸多孔支架,并考察了微球含量对复合支架力学性能、孔隙率、降解性能和吸水性能影响。当PLGA微球的含量不超过50%时,复合支架的多孔结构保持较好,孔径适合,孔隙率较高(>90%)。支架压缩模量随PLGA微球含量的增加而增大,当微球含量为50%和70%时,压缩模量分别达到0.53MPa和0.68MPa;同时,支架体外失重速度和吸水率随着PLGA微球的含量的增加而降低。体外软骨细胞培养表明,软骨细胞在PLGA微球含量为50%的复合支架中能够正常生长和增殖。PLGA微球复合的明胶/壳聚糖/透明质酸支架具有较好的力学性能和生物活性,是一种比较理想的软骨组织工程支架。用含有RGD配体的活性生物大分子和多肽对可注射性PLGA细胞微载体进行了改性研究。采用乳液溶剂挥发法制备了PLGA/明胶复合微球,然后以EDAC为交联剂,将RGDS多肽接枝到PLGA/明胶复合微球上。羟脯氨酸和蛋白含量测试结果表明,在改性PLGA/明胶复合微球中,明胶含量为0.9mg╱20mg(明胶/微球),RGDS的接枝量为2.1μg╱20mg(RGDS/微球)。采用SEM对改性微球的表面形貌进行了对比观察。体外降解实验表明,在PBS中PLGA/明胶和PLGA/明胶-RGDS微球失重速度较快,而在DMEM/FBS培养基中则明显变慢。体外软骨细胞培养表明,与PLGA微球比较,PLGA/明胶-RGDS微球更有利于细胞的粘附和生长,因此更适合用作细胞微载体或注射型支架。利用微量注射和胺解技术相结合的方法在PLLA膜表面制备胶原生物大分子梯度。通过控制注射速度在PLLA膜表面实现梯度胺解,获得氨基梯度分布的聚合物表面;以戊二醛为偶联剂,将生物大分子胶原固定在膜表面,获得了表面具有胶原梯度分布的PLLA膜。分别采用茚三酮法和羟脯氨酸法测定了梯度表面上氨基和胶原的浓度分布;扫描力显微镜(SFM)和静态接触角测试证明了材料表面的化学和物理性质的渐变过程。采用激光共聚焦显微镜(CLSM)观察了荧光素标记胶原(FITC-Col)梯度的PLLA膜表面。梯度氨基浓度分布呈“S”型。建立了数学模型对其进行了拟合,通过拟合计算得到梯度表面的氨基总量。细胞粘附结果表明,胶原梯度表面可以有效调控软骨细胞的粘附和铺展程度,这对研究具有诱导性的支架研发具有重要的指导意义。