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研究背景及目的全基因组关联研究（GWAS）是在人类全基因组范围内探索可能与疾病相关的遗传变异,是目前世界上的研究热点。最近十年GWAS的广泛应用已经鉴定出了上千个与乳腺癌风险相关的SNP位点,然而这些位点的生物学功能和机制还不清楚。由于这些SNP位点大部分位于基因的非编码区,使得阐明这些位点的生物学功能面临巨大的挑战。有研究表明,位于非编码区的SNP可能通过影响与反式作用因子的结合调控特定靶基因的表达,进而导致肿瘤的风险。乳腺癌是由遗传因素和环境因素共同导致的复杂疾病,遗传因素在乳腺癌的发病过程中发挥着重要的作用,其中遗传变异可解释约49%的遗传性乳腺癌风险。因此风险遗传变异位点可看作是鉴别乳腺癌的生物标志物,阐明这些风险SNP的生物学功能对乳腺癌的预测、诊断具有重要的意义。实验室前期通过高通量报告基因系统分析发现,乳腺癌风险位点rs2236007具有显著的基因调控活性。rs2236007位点首先是在欧洲人群中报道的与乳腺癌风险相关,P=1.7×10-13,位于PAX9基因第三个内含子上,风险等位基因为G,正常等位基因为A,其导致乳腺癌的风险机制还不明确。本研究目的是鉴定与SNP位点rs2236007结合的转录因子,探索其调控的下游靶基因及其在乳腺癌发展中的作用,运用数据库分析、分子生物学、细胞生物学等手段,阐明乳腺癌风险位点rs2236007的生物学功能及其分子机制,为乳腺癌的早期筛查和诊断提供新的分子标志物。研究方法1.针对实验室前期通过高通量报告基因系统筛选出的具有基因调控活性的SNP位点,进一步在ZR75-1细胞中进行报告基因分析,结合RT-qPCR实验确认rs2236007位点的基因调控活性,并通过数据库和文献分析rs2236007可能调控的靶基因;2.通过Sanger测序进行基因分型,确定含有rs2236007位点并且是杂合的细胞系,并且,针对rs2236007等位基因是杂合的细胞系,提取RNA制备cDNA样品,通过Sanger测序检测rs2236007位点在转录水平是否存在等位基因选择性,并对潜在调控的靶基因的外显子进行基因分型,寻找其他的杂合SNP位点作为标签,通过Sanger测序进一步确认该杂合位点在cDNA中的等位基因选择性,判断其与rs2236007之间的一致性,明确rs2236007对下游基因的调控关系;3.通过FAIRE-qPCR、ChIP-qPCR实验验证rs2236007是否位于染色质开放区域,并进一步确认rs2236007在FAIRE和ChIP DNA中等是否存在类似的等位基因选择性;4.设计CRISPRi/CRISPRa实验,通过靶向rs2236007位点区域的sgRNA,验证rs2236007是否具有基因调控功能,及其对下游靶基因表达水平的影响;5.通过Cistrome、RegulomeDB等数据库预测可能与rs2236007结合的转录因子,用JASPAR数据库对预测的转录因子结合基序进行分析;6.通过敲低和过表达转录因子,检测其对靶基因表达水平的影响,确认与rs2236007位点相互作用的转录因子;7.通过敲低靶基因检测细胞增殖,进一步验证rs2236007及其靶基因对肿瘤生长特性的影响;8.通过数据库中的临床样本信息,分析PAX9基因表达水平对乳腺癌患者生存能力的影响。研究结果1.实验室前期的高通量报告基因分析结果,在乳腺癌细胞系MCF-7中共筛选出55个可能具有基因调控活性的SNP位点,本研究选择其中一个SNP位点rs2236007,其风险等位基因G的活性低于正常等位基因A的活性,差异显著。并且转染MCF-7和ZR75-1细胞进行报告基因分析,RT-qPCR检测结果与二代测序结果相一致,我们通过数据库eQTL分析发现rs2236007位点调控的靶基因可能为PAX9;2.rs2236007位于PAX9基因的第三个内含子中,在MCF-7、ZR75-1、BT474、SKBR-3细胞系中为A/G杂合。Sanger测序分析,在cDNA样品中,rs2236007等位基因A的表达水平高于等位基因G,并且PAX9基因第四个外显子上的另外两个杂合SNP位点rs12881240和rs4904210也表现出明显的等位基因选择性,与rs2236007位点高度一致,这进一步确认rs2236007位点对PAX9基因的调控作用;3.FAIRE-qPCR结果显示,rs2236007在十种乳腺癌细胞系的开放染色质中均有富集,针对染色质活性标志物H3K4me3和H3K27ac的ChIP-qPCR和ChIP-seq分析表明在MCF-7细胞中,rs2236007位点区域在H3K4me3和H3K27ac的ChIP DNA中有显著富集,并且在FAIRE和ChIP DNA中rs2236007表现出显著的等位基因选择性;4.rs2236007为一个调控区域,影响PAX9的表达;5.RegulomeDB和JASPAR数据库预测rs2236007可能与转录因子EGR1结合;6.敲低转录因子EGR1后,PAX9表达上调,表明EGR1可能是识别结合rs2236007位点的转录因子;7.细胞增殖实验结果显示,PAX9影响乳腺癌细胞的增殖;8.对Kaplan Meier-plotter数据库中的临床样本的分析表明,PAX9的表达水平对乳腺癌患者细胞的预后有影响。研究结论本研究结果初步表明转录因子EGR1可以和乳腺癌风险相关遗传变异位点rs2236007的风险等位基因G结合,下调PAX9基因的表达水平,进而导致了乳腺癌的风险。研究结果对rs2236007用于乳腺癌的早期诊断和早期干预提供了有力的证据。