一、背景与目的冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)是当今人类健康的“头号敌人”,冠心病治疗费用也位列许多国家政府卫生保健支出之首。如何有效地防治冠心病成为临床心血管病学的重要课题。虽然经皮冠状动脉介入(PCI)治疗或/和冠状动脉旁路移植术(CABG)并联合强化的药物治疗获得重要突破和进展,但仍有部分冠心病患者不能有效恢复完全的心肌血流灌注,还有20%~70%的冠心病患者不能施行PCI或CABG,或者接受了不完全的血运重建,使患者死亡率增高,临床预后险恶。治疗性血管生成通常利用外源性重组基因治疗以促进缺血心肌的侧支循环形成,使冠脉灌注得以恢复,从而改善心脏功能和临床预后,是严重缺血性心脏病患者传统治疗措施的补充或替代方法。组织损伤后产生内源性电场,这是种稳恒直流电场,具有促进损伤愈合等生物学效应。损伤和缺血组织中存在电势差,当这个直流电场达到150～400mv/mm时,能促使包括平滑肌细胞和内皮细胞在内的所有的血管壁细胞明显地延长、垂直取向和定向迁移,从而触发血管新生、并进一步发展成熟为具有功能作用的侧支循环。因而,稳恒直流电场刺激可望成为治疗性血管生成的新希望。组织缺血缺氧是血管生成的原始刺激因素,血管内皮生长因子(VEGF)是血管形成的特异性和关键性生长因子。缺血导致心肌细胞中缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的激活,进一步刺激VEGF等生长因子的表达,而磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶(PI3K/Akt)通路在通过HIF-1α调节的VEGF的表达中起重要作用。第10号染色体丢失的张力蛋白同源的磷酸酶基因(PTEN),对P I3K/Akt信号通路起负调节作用。最近的研究证实外加电场对细胞的生物学效应是通过PTEN/ PI3K信号途径来发挥作用的。本课题在以往研究的基础上以兔心脏为研究的基本模型,对外加低压稳恒直流电刺激直接作用于心脏的安全性、血管生成的有效性、血管生成后对兔心功能的影响进行全面的分析,并进一步探讨外加低压稳恒直流电影响急性心肌梗死(AMI)后梗死边缘区血管生成的可能机制。二、方法第一部分外加低压稳恒直流电场对AMI兔的安全性评估。日本大耳兔30只,随机分为治疗组和对照组。家兔开胸后直接在心外膜上,在结扎的冠状动脉左回旋支的两侧平行安放一对刺激电极。电极为含量99%铂(Pt)条改制的长10.0mm、宽1.0mm、厚0.5mm片状铂金电极头。术后立即给予电场强度4.0V/cm、30min/d直流电治疗,直至术后4周。观察低压稳恒直流电场对家兔呼吸、循环、心电生理、血液、血生化以及病理组织学的影响。第二部分外加低压稳恒直流电场对兔AMI后血管生成的影响及其效应日本大耳兔95只,随机分为假手术组(SH组)、心肌梗死组(MI组)、电治疗组(EFs组)[包括2.0V/cm电治疗组(2EFs组)和4.0V/cm电治疗组(4EFs组)],除SH组以外,其余三组分别观察术后1天、3天、5天、7天、2周和4周6个时相点,每组5只兔。在相应的模型建立后第二天开始,给予兔体外施加低压稳恒直流电刺激(电场强度2.0V/cm或4.0V/cm),持续30min/d,直到术后各组观察终点。多导生理仪有创监测左室血流动力学参数和股动脉压;处死动物后,测量左、右心室的重量;通过Masson染色判断梗死面积;VIII因子免疫组化染色观察毛细血管密度;RT-PCR检测单核细胞趋化蛋白-1的表达以判断炎症反应强度;RT-PCR及Western-blot检测基质金属蛋白酶-2(MMP-2)的表达。第三部分外加低压稳恒直流电场促进兔AMI后血管生成的机制在第二部分研究基础上,增加以罗格列酮干预的18只兔。以免疫组化方法、RT-PCR及Western-bolt观察上述各组缺血心肌组织VEGF的表达;免疫组化方法及RT-PCR检测HIF-1α的表达;RT-PCR及Western-bolt观察罗格列酮干预前后PTEN的表达;VIII因子免疫组化染色观察罗格列酮干预前后心肌毛细血管密度。三、结果(1)通过胸骨正中切口开胸、结扎左冠状动脉回旋支(LCX)建立AMI的方法,不用气管插管或气管切开建立人工辅助呼吸,简化了手术操作、保持胸膜的完整、避免胸腔大血管的损伤,减少了感染和出血等并发症的发生。(2)经过改良后的铂电极,电极头面积较早期实验所设计的增加近2/3并凿刻小槽,有利于电极固定在心外膜上。电极柔韧性增加,通过延长的皮下隧道固定于兔的颈背部的方法便于手术操作、安全、可靠,有效地降低了电极脱落的机率。(3)4.0V/cm、30min/d的低压稳恒直流电场对AMI兔在手术后4周之内,无论是呼吸、循环、血液、生化、心肌病理组织学改变还是一般情况等,与对照组比较无显著差异,提示都是安全的。(4)低压稳恒直流电场治疗后,兔MI边缘区心肌组织中毛细血管的密度比MI对照组显著增多,尤其在4.0V/cm场强的电治疗组。毛细血管的密度在术后第5天达到高峰,此后稍有减少并稳定至术后4周。同时EFs组在术后4周MI面积较MI组缩小,左心室功能显著改善。(5)AMI后心肌组织中MCP-1表达较SH组显著增加,但EFs组和MI组无统计学差异;术后4周,EFs组MMP-2表达较MI组显著降低。(6)MI缺血心肌组织中HIF-1α以及VEGF表达较正常心肌组织增加,给予外加低压稳恒直流电刺激后在一定时间窗内可显著促进梗死边缘区心肌组织中HIF-1α以及VEGF的表达;(7)正常心肌组织中PTEN高表达,心肌梗死后PTEN表达下调。外加低压稳恒直流电刺激后3天内使梗死边缘区心肌组织中PTEN表达较对照组降低,随后PTEN表达在电场干预下迅速增加,并在术后4周达到较高的水平;(8)罗格列酮可使缺血心肌组织中PTEN表达显著增加并伴随着VEGF表达和毛细血管密度的降低,提示低压稳恒直流电刺激可能通过PTEN/PI3K/Akt/HIF-1α/VEGF通路促进MI后梗死边缘区心肌组织血管生成的增加。四、结论(1)4.0V/cm、30min/d的外加低压稳恒直流电场对兔AMI后4周之内,无论是对呼吸、循环、血液、生化、心肌病理组织学改变的影响还是一般情况等,与对照组比均无显著差异,提示是安全的。(2)外加低压稳恒直流电治疗4周后,MMP-2表达较MI组显著降低,MI面积缩小,同时左心室心肌肥厚指数下降,左室收缩功能明显改善,尤其在4.0V/cm场强的电治疗组。(3)外加低压稳恒直流电场治疗后,梗死边缘区心肌组织中毛细血管的密度比MI对照组显著增加,尤其在4.0V/cm场强的电治疗组。延长电刺激的时间,毛细血管密度并没有继续进一步增加。(4)外加低压稳恒直流电刺激后早期,缺血心肌组织中PTEN表达较MI对照组降低,同时VEGF及HIF-1α表达升高;罗格列酮药物干预后PTEN表达增加并伴随着VEGF表达和毛细血管密度显著降低,提示外加低压稳恒直流电刺激可能通过PTEN/ PI3K/ Akt/HIF-1α/VEGF通路,促进MI后梗死边缘区心肌组织血管生成的增加。