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前言 目前临床已经证明地西泮用于分娩期促进宫颈成熟和扩张效果理想，已经成为分娩期第一产程处理的基本用药。但是对于地西泮促进宫颈成熟和扩张的机理至今仍缺少基础研究的支持。目前研究表明宫颈胶原的降解是宫颈成熟和扩张的组织学基础，胶原酶是基质金属蛋白酶(Matrix Metalioproteinase MMPs)类之一。本文通过研究地西泮对人子宫下段成纤维细胞产生基质金属蛋白酶9(MMP-9)的影响，在细胞水平上进行地西泮促宫颈成熟和扩张机理的基础研究，为阐明地西泮促进宫颈成熟和扩张的机理提供理论依据． 材料和方法 一、仪器、材料及试剂 人MMP-9RT-PCR试剂盒购自美国Promega公司，人MMP-9酶联免疫试剂盒购自深圳晶美公司，改良的Eagle培养基(DMEM)购自美国GIBCO公司，新生牛血清，胰酶，奥地利泰康酶标仪，二氧化碳培养箱，倒置显微镜，超速离心机，PCR扩增仪，电泳仪，电泳槽，凝胶成像分析系统。 二、方法 1 人子宫下段成纤维细胞的培养分组及处理 取正常孕妇子宫下段蜕膜组织，完成人子宫下段成纤维细胞原代培养。当细胞融合成单层细胞后，传代纯化。细胞融合后，加入无血清培养基培养24小时，然后添加含有不同浓度地西泮的选择培养基，分别在培养3，6，12，24小时后收集培养液，1000g/min离心4分钟后取上清冻存。用刮匙将培养瓶底壁上的细胞刮下，放入小安甄内并加入变性液冻存。 2 采用ELISA法测定细胞上清液中MMP-9含量。 3 采用RT-PCR法测定子宫下段成纤维细胞MMP-9的mRNA表达量。 (1)总RNA提取。(2)RNA逆转录成cDNA。(3)聚合酶链式反应。(4)PCR产物的检测及半定量。结果1细胞培养液内MMP一含量的变化人子宫下段成纤维细胞在含有地西伴浓度为1 x10一7M中培养3小时后，可见MMP一含量较对照组明显增加(P<0的选择培养基.05)。随地西伴浓度的升高，这种促进作用更加明显;且随时间延长这种作用更强。地西浮浓度1 xlo一’M作用24小时后MMP一升高的程度最为明显。2各组MMP一的浓度为1 xlo一，MmRNA相对表达量比较地西伴组在作用人子宫下段成纤维细胞12、24小时MMP一mRNA的表达较无地西伴组显著增高(P<0.05);且地西浮浓度为1 x 10一，M，(P<0 .05)。1 x10一’M时各个时间段均可明显促进MMP一mRNA的表达讨论 宫颈成熟对于正常妊娠及分娩具有重要意义。分娩发动时宫颈扩张成熟，促进一连串分娩动作完成。宫颈成熟在大体解剖上表现为宫颈变软，紫蓝着色，子宫下段拉长，宫口逐渐松弛开大，临床上常用BisHOP评分进行评估。宫颈成熟在组织生化学上，是通过宫颈组织的细胞成分与细胞外基质相互作用发生一系列生化反应完成的。细胞外基质成分的变化主要是胶原纤维含量减少，分布稀疏，排列不整齐;胶原酶含量增加;透明质酸含量增加;氨基葡聚糖总量增加，硫酸已酞肝素与硫酸软骨素比率增加;弹性蛋白增加。细胞成分的变化有妊娠早期宫颈细胞数量增加，同时伴有浸润间质的中性粒多形核细胞和巨噬细胞增多。二、基质金属蛋白酶的理化特性和功能 基质金属蛋白酶(MMPS)是一类含有锌，钙的蛋白水解酶类，主要参与细胞外基质代谢，可降解细胞外基质至少一种组成的蛋白酶。目前已发现的基质金属蛋白酶(MMPS)的成员中按其底物的特异性和原始结构分为胶原酶类，明胶酶类，基质溶解素类和膜型MM玲类。这些MM玲参与很多生理过程，如胚胎发育，分娩发动，产后子宫恢复，子宫内膜周期性剥脱及一些病理过程，如类风湿关节炎，牙周病，肿瘤侵袭等。MMPS以酶原形式从细胞分泌，需经蛋白酶等的水解和修饰后才有活性。胎盘和胎膜中主要的MMPS有1，2，3，9型，宫颈中主要有1，2，3，8，9型，其中胶原酶在胶原距氨基端3/4处将其分解为Tc人TcB片段，这两个片段在体温下自行变性成明胶，可被明胶酶分解为更小的片段，再有非特异蛋白酶完全降解。由于MM玲在妊娠生理、病理条件下的复杂机制，本研究采用酶联免疫分析法和反转录PCR方法测定经地西浮处理的人子宫下段成纤维细胞产生MMP的量，也同样验证了MMP一参与宫颈成熟。 三、MMPg与宫颈成熟和扩张的关系。 Winkler等对子宫下段组织中MM即浓度进行研究发现:当宫口开大<2厘米，其浓度为15.4n留mg;当宫口开大24厘米时浓度为25.4n岁mg;当宫口开大4石厘米时，其浓度为69.sn盯mg;当宫口开大>6厘米时，其浓度为102.In扩mg，从而提出宫颈成熟和扩张与MM即浓度升高有关。Ath叮de等人对不同孕龄孕妇羊水中MM即浓度进行测定发现MMPg浓度随孕龄增加而升高，故认为MMPg在妊娠的进展、.宫颈成熟过程中起重要作用。Umada证实子宫下段成纤维细胞产生Pro一基质金属蛋白酶9，提示MMP-9参与宫颈成熟扩张。Rajabim通过获取典型的胶原降解产物并电泳的方法来测定未孕及妊娠妇女宫颈组织中胶原酶含量，研究胶原裂解、宫颈成熟与胶原酶的关系最后得出结论:胶原酶含量升高促进宫颈成熟扩张。 既然MM凶与宫颈成熟关系密切，本实验用不同浓度