第一部分　　 [背景与目的]　　 骨重塑(bone remodeling)的失衡是多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma,MM)患者骨病(myloma bone disease，MBD)产生的主要原因。在骨髓微环境中，MM细胞通过分泌各种细胞因子或直接的细胞-细胞相互作用，刺激破骨细胞(osteoclast，OC)活化，抑制成骨细胞(osteoblast，OB)的形成和功能，导致骨重塑平衡的严重失调，产生骨痛、骨质破坏、高钙血症等骨相关事件。蛋白酶体抑制剂硼替佐米(Bortezomib，Bzb)可治疗骨髓瘤骨病，其作用靶标是间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)。我们以FHL2为切入点探讨硼替佐米诱导骨髓瘤患者间充质干细胞向成骨细胞分化过程中的作用机制，从而探讨Bzb对骨重塑平衡的修复作用及其机制，为MBD的治疗提供实验和理论依据。　　 [方法]　　 (1)MM-MSCs诱导培养和鉴定：采集MM患者骨髓标本，Ficoll法分离骨髓单个核细胞，经CD138磁珠分选后，贴壁培养阴性细胞获得MSCs。CD138阳性细胞和获得的MSCs进行免疫荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)检测遗传学。8nMBzb处理后鉴定成骨分化能力。　　 (2)Bzb诱导MSCs向OB分化中FHL2的变化：给予不同浓度的硼替佐米(0、2nM、5nM、10nM)分别处理MM-MSCs24h，采用Western-Blot法在蛋白水平检测硼替佐米处理前后FHL2表达水平的变化确定诱导浓度；Bzb诱导7天，提取总RNA，荧光定量RT-PCR检测成骨分化的3个特异性指标碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、胶原酶1a1(typeⅠcollagen，CoIIAl)、Runx2.诱导21天，进行茜素红和von kossa染色检测矿化情况．　　 (3)FHL2沉默对Bzb诱导MSCs向OB分化的影响：为进一步明确FHL2基因在MM-MSCs成骨分化中的作用，构建了重组pLKO.1-shRNA-FHL2(sh-FHL2)慢病毒载体，转染MM-MSCs，观察sh-FHL2的MM-MSCs的成骨分化能力。　　 (4)FHL2在Bzb诱导MSCs向OB分化的作用机制探讨：FHL2的表达具有野生型p53依赖性，我们遁过Western Blot观察Bzb处理24小时后p53和CyclinD1的水平变化。使用2 mM thymidine双阻滞后流式细胞术观察细胞周期。已知FHL2与β-catenin直接作用，促进其入核。我们通过免疫荧光的方法，标记FHL2和β-catenin，观察Bzb处理下MSCs分化过程中两个蛋白的表达和定位。　　 [结果]　　 (1)成功获得MM-MSCs。使用13q14(RB-1)，14q32(IGHC/IGHV)，1q21(CKSIB)，和17p13(TP53)探针检测6例患者浆细胞(plasmacells，PCs)和对应的MSCs的遗传学异常，发现MM-MSCs不具有相应浆细胞的遗传学异常。　　 (2)Bzb能诱导MM-MSCs成骨分化；FHL2蛋白表达水平在Bzb处理后上调。Western Blot分析显示FHL2蛋白水平在Bzb处理24小时后升高，10nM以下具有剂量依赖。实时定量RT-PCR显示7天的Bzb处理在诱导FHL2表达的同时，促进了成骨标志基因Runx2，ALP和CollA1的表达。　　 (3)FHL2基因沉默削弱Bzb诱导的MM-MSCs成骨分化。Western Blot和实时定量RT-RCR结果证明成功获得稳定敲除表达FHL2的MM-MSCs(sh-FHL2)。与对照sh-SCR相比，sh-FHL2削弱了Bzb诱导的成骨标志基因Runx2，ALP和CollA1 mRNA水平的表达，同时茜素红染色证明了sh-FHL2能削弱Bzb诱导的矿化形成。　　 (4)p53和p21表达水平在Bzb处理后提高。Bzb处理24小时后，CycinD1蛋白水平没有变化，p53水平上升。p21蛋白水平在thymidine双阻滞释放后有时间依赖的表达升高。阻滞释放后，sh-FHL2比sh-SCR先进入G1期（9小时vs.12小时）。　　 (5)sh-FHL2削弱了Bzb诱导成骨分化过程中的β-catenin入核。免疫荧光检查结果显示，sh-FHL2削弱了Bzb诱导成骨分化过程中的β-catenin入核，同时β-catenin在Bzb处理后被限制在了核附近。　　 [结论]　　 FHL2在Bzb诱导的MM-MSCs成骨分化过程中起重要作用，能够促进成骨形成。蛋白酶体抑制剂治疗和靶向FHL2的策略为治疗骨髓瘤骨病提供很好的实验和理论依据。　　 第二部分　　 [背景与目的]　　 骨重塑的生物化学标志（biochemical markers）是评价多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma，MM)患者骨病状态和跟踪抗骨病药物效果的重要工具。骨髓瘤患者骨髓浆活化素A(Activin A)表达水平随着患者溶骨性破坏程度而提高。本研究目的在于评价我国骨髓瘤患者外周血血清的Activin A表达水平与骨髓瘤骨病状态的关系。　　 [方法]　　 应用ELISA测定初治骨髓瘤患者外周血血清中Activin A和骨特异性碱性磷酸酶(Bone-specific Alkaline Phosphatase，BAP)的含量，分析其与患者骨侵犯的相关性，评价其在MM患者骨病治疗疗效判断，病情监测中的意义。　　 我们把骨侵犯分为5级：正常（0级）；仅有骨质疏松（1级）；骨质疏松伴单一溶骨性损害（2级）；骨质疏松伴广泛性溶骨性损害（3级）；广泛性溶骨性损害伴病理性骨折（4级）。　　 [结果]　　 (1)患者疾病特征：113例初治骨髓瘤患者中，0级23例(20.35％)，1级5例(4.42)，2级15例(13.27%),3级56例(49.56%),4级14例(12.39%)。　　 (2)外周血因子水平检测：Activin A水平、BAP水平与有无溶骨性破坏正相关(p＜0.05)。硼替佐米治疗初步显示可以维持或降低Activin A水平。　　 [结论]　　 Activin A水平与有无溶骨性破坏正相关，起到与对照骨特异性碱性磷酸酶类似的效果，可以考虑作为新的指标在实际临床中应用。同时，初步研究显示硼替佐米治疗可以维持或降低Activin A水平，可以考虑扩大样本量继续研究。　　 第三部分　　 [目的]　　 比较自体移植患者和异体移植正常供者动员后采集物中CD34+细胞表面黏附分子表达水平，探讨其与造血重建的相关性。　　 [方法]　　 中国医学科学院血液病医院的自体移植患者和异体移植供者。患者接受与其疾病相关化疗联合每天10ug/kg的G-CSF动员，正常供者采用相同剂量的G-CSF动员策略。采集大多在供者动员第五天，或自体患者外周血白细胞数达到5×109/L，外周血CD34+细胞多于每uL5个细胞时进行。采集目标是5×106CD34+细胞/kg。　　 CD34+表面分子表达检测：收集干细胞采集第一天的采集物标本，通过流式检测CD34+细胞表面黏附分子CD11a，CD11c，CD49d，CD49e，CD54和CD62L的表达水平。同时检测采集物的CD133+CD34+细胞比例和CD34+细胞表面CXCR4的表达水平。　　 植活指标是中性粒细胞植活为回输（第O天）后的病人血中性粒细胞计数最少维持在500/uL的第一天。血小板植活为患者1）血小板最少20×109/L且2）前7天不需要输血小板的第一天。　　 [结果]　　 收集了6例异体移植和7例自体移植患者的动员采集物。异体移植患者均为ALL，供者中位年龄39(35-44)岁；自体移植患者6例，包括：多发性骨髓瘤3例，急性淋巴白血病2例，恶性淋巴瘤2例，中位年龄24(15-58)岁。干细胞动员前，所有患者都接受了与自己疾病相关的多疗程的化疗，结合G-CSF的支持。　　 异基因移植与自体移植相比，外周血采集物CD34+细胞表面的黏附分子CD11aCD11c，CD49d，CD49e，CD54和CD62L表达水平无统计学差异。CD34+CD133+比例和CD34+细胞的CXCR4表达水平的差异也无统计学意义。分析CD34+细胞各分子表达与中性粒细胞植活天数、血小板植活天数的相关性，CD11c水平与血小板植活相关，有统计学意义(p=0.002)，其它分子则与移植后造血植活无统计学相关性。　　 [结论]　　 异基因移植与自体移植相比，采集物CD34+细胞表面的黏附分子水平，除了CD11c，其它黏附分子、CD133、CXCR4表达水平无统计学差异；另外，只有CD11c与造血植活有统计学相关性。由于病例数偏少，需要进一步扩大样本量。