【摘 要】
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先天免疫是抵抗病原微生物侵害的第一道防线。当病毒感染机体后,入侵病毒可通过模式识别受体(PRR)进行识别,病毒RNA主要是双链(ds-)RNA,可被三种PRR识别:Toll样受体3(TLR3),胞质视黄酸诱导基因I(RIG-1)样受体(RLR)以及核苷酸寡聚化域(NOD)样受体(NLR)。TANK结合激酶1(TBK1)作为这些受体反应的中心,是一个含有729个氨基酸的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,其包含
【基金项目】
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国家自然科学基金(31960735); 江西省自然科学基金(20171ACB20004); 江西农业研究系统专项基金(JXARS-04);
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先天免疫是抵抗病原微生物侵害的第一道防线。当病毒感染机体后,入侵病毒可通过模式识别受体(PRR)进行识别,病毒RNA主要是双链(ds-)RNA,可被三种PRR识别:Toll样受体3(TLR3),胞质视黄酸诱导基因I(RIG-1)样受体(RLR)以及核苷酸寡聚化域(NOD)样受体(NLR)。TANK结合激酶1(TBK1)作为这些受体反应的中心,是一个含有729个氨基酸的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,其包含一个N末端的激酶结构域、一个泛素样结构域、一个二聚化结构域和一个可以与TANK相互作用的C末端结构域,这些结构域确保了TBK1功能的多样性。TBK1可以磷酸化干扰素调节因子3(IRF3),IRF3随后发生二聚化易位至细胞核调控IFN 1的表达。SRC是Src家族激酶(SFK)的成员,参与许多细胞过程,包括炎症、细胞凋亡和先天免疫。在哺乳动物中,SRC从N端到C端包括一个特有的SRC同源(SH4)结构域、一个结合特定的富含脯氨酸基序(PRM)的SH3结构域、一个SH2激酶连接子结构域和一个C端Tyr激酶结构域(CSK)。SRC参与TBK1介导的IFN1信号通路,并且SRC的免疫学功能取决于其与TBK1的相互作用。迄今为止,尚未在草鱼中研究过SRC,为了探究SRC在草鱼先天免疫中的功能。在本研究中,我们克隆了草鱼(Ctenopharyngodon idella)SRC(CiSRC)的ORF,其全长为1599bp,编码一条532个氨基酸的多肽。系统进化分析结果显示,CiSRC与犀角金线鲃SRC(SrSRC)同源性最高。蛋白质结构分析表明,草鱼SRC包含一个SH3、一个SH2和一个Tyrkc结构域。当我们用poly(I:C)刺激草鱼组织和细胞后发现,在poly(I:C)刺激6h后,脑、肠、鳃、皮肤、肝、脾和肾组织中SRC m RNA表达量到达峰值,随后逐渐降低;而在眼中的峰值则为刺激12h后,同样在达到峰值后会逐渐下降;在细胞水平,外源刺激时,CiSRC m RNA表达量会有明显上调,在12h达到峰值,之后逐渐下降并恢复至本底水平左右;而在内源刺激时,CiSRC mRNA表达量也会有明显上调,在6h达到峰值,之后逐渐下降至本底水平。这些结果表明CiSRC可以响应poly(I:C)的刺激。为了进一步研究SRC的功能,我们研究了CiSRC和Ci TBK1的亚细胞定位,结果表明,CiSRC位于CIK细胞的细胞质和细胞核中,而CiTBK1仅位于CIK细胞的细胞质中。我们将GFP-CiSRC和FLAG-Ci TBK1共转染到CIK细胞中,发现它们在细胞质中共定位,这预示着SRC与TBK1可以相互作用。接着GST pull-down和免疫共沉淀实验表明,CiSRC和CiSRC酪氨酸激酶结构域缺失突变体(SRC-ΔTyrkc)可以分别与Ci TBK1相互作用。磷酸化分析结果显示CiSRC促进Ci TBK1的磷酸化。此外,在poly(I:C)刺激下,CiSRC同样可以促进Ci TBK1的磷酸化。我们还证明了CiSRC可以上调Ci IFN 1的表达,而在缺失酪氨酸激酶结构域后,CiSRC并不会对Ci IFN 1的表达产生影响。以上这些结果表明,CiSRC通过与Ci TBK1结合然后上调Ci TBK1的磷酸化水平来启动先天性免疫应答。
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