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茭白原产中国,因其营养丰富、味道鲜美,具有很高的药用价值,已成为我国第二大水生蔬菜。菰黑粉菌（Ustilago esculenta）专性寄生茭白植株（Zizania latifoli）,抑制植株开花并诱发其茎基部膨大形成可食用的茭白。研究表明,菰黑粉菌与玉米黑粉菌类似,具有酵母型和菌丝型两种型态,是一种典型的二态性真菌。而真菌二型态转换,即酵母型与菌丝型之间的转变是二态性真菌致病的关键。前期研究发现,精氨酸是促进多数病原真菌由酵母型向菌丝型转换实现侵染的重要因子。项目组前期对菰黑粉菌的研究则发现:外源精氨酸显著抑制菌丝形成,与其在真菌中被广泛证实的正向调控作用相反,表明精氨酸调节真菌二型态转换的机制存在多样性。本研究拟克隆鉴定精氨酸合成代谢途径基因,并通过体外融合实验（体外培养促使菰黑粉菌完成从酵母型向菌丝型转换）、显微观察、荧光定量PCR等方法对这些基因的生物学功能进行研究,明确精氨酸在菰黑粉菌生长、致病力及二型态转换中的作用及作用机制。首先,克隆得到了精氨酸合成途径基因UeArg1、UeArg2、UeArg3、UeArg4、UeArg5,6、UeArg7、UeArg8和精氨酸代谢途径基因UeArginase共8个基因的基因组序列和cDNA序列。对这些基因的基础信息、蛋白结构以及同源性进行了比对分析,表明菰黑粉菌体内存在完整的精氨酸合成和代谢调控系统。有研究报道精氨酸通过代谢产生的CO2作用于cAMP-PKA途径影响真菌的二型态转换,因此进一步对精氨酸代谢途径基因UeArginase展开研究,表达模式分析发现:UeArginase在T型菌株融合过程中表达持续降低,且在二型态转换时期表达量显著低于基础水平;体外融合试验结果表明:UeArginase的基因缺失菌株与外源添加过量精氨酸的结果类似,均延迟了二型态转换发生的时间,同时HPLC检测结果表明:融合过程中内源精氨酸呈下降趋势,而UeArginase的基因缺失菌株和外源添加精氨酸均导致内源精氨酸的增加。因此推测在菰黑粉菌中,可能是精氨酸本身,而不是精氨酸代谢途径参与二型态转换。进一步对精氨酸合成途径基因功能展开初步的研究。对合成途径基因UeArg1、UeArg2、UeArg3、UeArg4、UeArg5,6、UeArg7、UeArg8在T型菌株融合过程中的表达模式进行分析发现:UeArg1在二型态转换关键时间点24 h表达量最高;UeArg3、UeArg4在二型态转换的时间段12-48 h内其表达量呈逐渐下降趋势;UeArg2、UeArg7在二型态转换的时间段12-48 h内其表达量呈逐渐上升趋势;UeArg8在二型态转换完成后其表达量才有显著上升;而UeArg5,6在二型态转换过程中表达量没有显著变化。进一步进行基因敲除,通过体外融合、人工接种和显微观察试验,结果表明:UeArg1缺失菌株变短变粗,生长速率变慢,但在YEPS培养基上其二型态转换不受影响;UeArg2、UeArg7基因缺失不影响菌株的单倍体生长和体外融合能力;UeArg4缺失菌株出现多位点芽殖;UeArg3、UeArg5,6基因缺失致使单倍体形态变短变粗,生长速率变慢,体外融合能力减弱;UeArg8基因缺失菌株生长速率变慢,体外融合能力增强。侵染实验发现,除UeArg4基因缺失菌株呈现良好的侵染态势外,其他基因缺失均减弱了菌株的致病性。综合以上结果,发现UeArg3、UeArg5,6、UeArg8对菰黑粉菌单倍体生长、体外融合过程和致病力影响显著。前期研究表明,这三个基因是精氨酸反馈调节基因。因此进一步对反馈调节途径UeArg3、UeArg5,6、UeArg8的生理学功能及其在菰黑粉菌二型态转换中的作用机制展开研究。在YEPS、YEPS+0.2%L-Arginine、CM、CM+0.2%L-Arginine四种培养基上对UeArg3、UeArg5,6、UeArg8进行形态和生理学功能研究。其中单倍体生长试验结果显示UeArg3、UeArg5,6、UeArg8基因缺失菌株的生长速率与对照相比均有不同程度的减慢。在CM培养基上,UeArg3、UeArg5,6、UeArg8的生长速率与对照的差异比在YEPS培养基上显著;外源添加精氨酸后,其生长速率在YEPS培养基上差别较大而在CM培养基上差别较小。单倍体显微形态观察结果显示UeArg3和UeArg5,6基因缺失菌株单倍体较对照变短粗,而UeArg8基因缺失菌株在四种培养基上的单倍体形态与对照均没有显著差异。体外融合试验结果及该过程中MAPK和PKA途径关键基因Uekpp2、Uekpp6、UePkaC和UePrf1的表达量分析表明:UeArg3缺失菌株在不同培养基上融合能力比对照弱,但是其接合管生长的关键时间点（如YEPS上的24 h）,Uekpp2、Uekpp6、UePkaC和UePrf1均呈现高表达,表明该基因缺失可能不影响MAPK和PKA途径;UeArg5,6缺失菌株的菌丝长度较对照显著减小,Uekpp2、Uekpp6、UePkaC和UePrf1均呈现低表达;而UeArg8缺失菌株融合时间较对照提前,且菌丝长度显著长于对照,Uekpp2、Uekpp6、UePkaC和UePrf1呈持续高表达趋势。因此推测,UeArg5,6和UeArg8可能通过MAPK和PKA途径来调控菰黑粉菌二型态转换。上述研究结果初步明确了精氨酸合成与代谢途径基因在菰黑粉菌单倍体生长、形态及其融合过程中的作用,为进一步研究菰黑粉菌精氨酸合成代谢调节机制在与茭白互作中的作用奠定了基础。