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L-酪氨酸羟化酶(HDP)在生物学上担任着非常重要的角色,它催化L-酪氨酸转变为L-多巴,酪氨酸羟化酶的缺乏会导致多巴胺以及肾上腺素和去甲肾上腺素的合成受损。类弹性蛋白(ELP)特殊的性质使其溶解度可根据环境温度而变化,且这一特性在它与其他蛋白连接之后仍然有效,因此被本课题用它来提高蛋白的溶解度、稳定性,并且成为了一种纯化的手段。本课题中的L-酪氨酸羟化酶是一类依赖于血红素的过氧化物酶,来源于菌种Streptomyces refuineus subsp.中的orf基因。1、本文利用本实验室构建的pET28a-HDP载体和pET28a-HDP-ELP载体转化大肠杆菌BL21得到表达菌,在25 ℃,0.4mMIPTG,200 rpm,诱导10h的条件下实现高效表达。运用Ni-NTA层析柱成功纯化出HDP蛋白,运用ELP的ITC循环纯化得到HDP-ELP。经过探究得知,HDP-ELP和HDP在90 min后的溶解度分别为初始溶解度的93%和63%;圆二光谱结果显示加入ELP标签并没有对HDP的二级结构产生影响,并且使其对过氧化氢的耐受性有所提高;HDP-ELP和HDP催化90 min后L-Tyr的转化率分别为70.3%和21.1%;在不同温度和pH的环境中,HDP-ELP都表现出十分稳定的酶活。2、由于HDP催化的必须底物除了 L-Tyr之外还有过氧化氢,因此本文引入了 D-氨基酸氧化酶(DAAO)催化D-丙氨酸产生过氧化氢这一过程为HDP的催化提供H2O2,这样就形成一个促进催化平衡向正向反应的结果。本课题还利用了基因工程的手段成功构建了pETDuet-HDP-IN-IC-DAAO 载体,转化大肠杆菌 BL21 后在 25 ℃,0.6mMIPTG,190rpm,诱导20h的条件下实现HDP-DAAO蛋白的高效表达。利用Ni-NTA层析柱成功纯化出HDP-DAAO蛋白。比较了 H2O2与D-Ala作为底物的HDP-DAAO的酶活,L-Tyr的转化率分别为52.8%和66.3%;HDP-DAAO中DAAO的比活也比单酶要高;圆二光谱的结果显示HDP-DAAO融合蛋白的构建并没有对HDP的结构产生影响;经过荧光淬灭实验得知HDP-DAAO融合蛋白的稳定性要比HDP单酶要好。