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黑果腺肋花楸(Aronia melanocarpa)是一种新兴小浆果果树。在世界上已有大面积栽培,但在我国栽培面积很小。由于黑果腺肋花楸有利用价值的显性基因的限制,使得通过常规育种手段改良栽培品种受到很大的限制。现已证明,利用生物技术手段,进行基因转移和体细胞融合可以克服自然界中形成的物种间的生殖隔离,为种质资源的创新提供了一种新的有效途径。 本试验首次以黑果腺肋花楸为材料,进行了离体叶片愈伤组织诱导、再生体系建立、细胞悬浮系的建立、原生质体分离、细胞培养和原生质体培养,以及相关的影响因素的研究,旨在建立黑果腺肋花楸叶片再生体系和细胞悬浮系,获得单细胞和原生质体再生植株,为今后黑果腺肋花楸遗传转化和体细胞杂交奠定基础。 1.黑果腺肋花楸离体叶片愈伤组织诱导 以叶片为外植体进行愈伤组织诱导试验的结果表明:植物生长调节剂的种类和浓度对黑果腺肋花楸愈伤组织类型和生长量均有很大的影响。单独使用细胞分裂素BA和CPPU不能诱导愈伤组织的形成,单独使用生长素NAA和2,4-D或者生长素(NAA、2,4-D和IBA)和细胞分裂素(BA、CPPU、ZT)配合使用均可以诱导愈伤组织的形成。在MS+2,4-D 1.0mg/L,3000Lux光照强度,白天25℃,夜晚20℃,16h光照,8h黑暗,pH6.0和蔗糖含量为3%为愈伤组织培养的最适宜条件,其鲜重和干重增加最多。只有2,4-D诱导的愈伤组织是疏松型,其它激素及其组合诱导的愈伤组织均为致密型。 2.黑体腺肋花楸离体叶片再生体系的建立 植物生长调节剂是影响叶片再生体系建立的主要因素。研究表明:生长素和细胞分裂素的浓度和组合对叶片再分化影响很大。NAA有利于根的分化,当NAA浓度为0.5mg/L时生根率最高为90%。细胞分裂素和生长素配合使用有利于芽的分化。在一步诱导法中MS+IBA1.0mg/L+BA3.0mg/L时诱导率最高为50%,但平均每个叶分化的芽数仅为2个。在两步诱导法中诱导愈伤组织形成使用WPM+CPPU2.0mg/L+2,4-D0.1mg/L的培养基,诱导的愈伤组织转入分化培养基WPM+CPPU2.0mg/L中,再生率可达到93.3%,并且平均再生芽数为15.2。使用两步诱导法建立了高效的再生体系。 3.黑果腺肋花楸细胞悬浮系建立 2,4-D诱导产生的白色疏松的愈伤组织可以建立细胞悬浮系,而MS+BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L所诱导产生的绿色致密愈伤组织不能建立细胞悬浮系。基本培养基采用MS优于B5、WPM、AA和N6培养基;在MS+2,4-D 1.0mg/L培养基中加入