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利用棉花细胞质雄性不育生产杂交种具有省工、省时和成本低等优点,因此“三系”配套生产棉花杂交种已成为一种必然趋势。目前国内外已经选育出了哈克尼西棉、三裂棉、异常棉、亚洲棉和陆地棉等不育系,其中哈克尼西棉、三裂棉和陆地棉的不育系实现了三系配套。已有研究表明哈克尼两棉不育胞质对杂种后代的产量有不利影响,在生产应用上没有取得实质性进展。2005年,本课题组首次研究培育出了第一个国家审定的比常规抗虫棉增产26.4%的三系杂交抗虫棉新品种,在生产上不但解决了棉铃虫的危害,而且促使棉花产量大幅度的提高。因此研究抗虫三系杂交棉不育和恢复的分子机理,对于恢复基因克隆和获得与恢复基因紧密连锁的分子标记进行分子辅助育种具有十分重要的意义。本文以抗虫三系杂交棉配制回交群体作图材料,构建了P30A细胞质雄性不育恢复系Y18R的恢复基因遗传图谱,获得与恢复基因紧密连锁的分子标记和BAC克隆,为进一步克隆恢复基因和育性相关基因奠定基础。配制（P30A×Y18R）×P30B回交群体BC1F1代,田间观察子代育性分离比符合1:1（可育:不育）,遵循孟德尔遗传规律,结果表明育性恢复性状是由1对显性基因控制。结合BSA的方法筛选与恢复基因紧密连锁的分子标记,共筛选576对ETS-SSR引物,获得1个新EST-SSR标记MGHES28。筛选已报道与恢复基因紧密连锁的7个RAPD标记、6个STS标记和11个SSR标记,结果表明7个RAPD标记UBC722、UBC188、UBC352、UBC683、UBC169、OPAE-052和UBC607分析回交群体没有多态性;2个STS标记Y1106和STS607分析回交群体没有多态性,2个SSR标记CIR222和CM42分析回交群体没有多态性。整合已报道的13个与Rf1基因紧密连锁的分子标记,Mapmaker软件遗传作图,构建细胞质雄性不育恢复系Y18R的恢复基因连锁的遗传图距总长为13.2cM,其中与最近的STS147标记遗传距离为0.1cM,新标记MGHES28与恢复基因遗传距离为2.4cM。利用QPIXⅡ机械手构建了陆地棉Y18R核基因组BAC文库两级菌液混合池（一级混合池和二级混合池）。一级混合池基于整个BAC文库构建,每个一级混合池包含10个二级混合池,共构建36个一级混合池。每个二级混合池基于1个384板。PCR三步法筛选BAC文库。以5个分子标记为探针筛选BAC文库,共获得21个阳性克隆。将阳性克隆末端测序,并设计末端序列引物,基于PCR的方法构建了BNL4047、BNL3535标记阳性克隆的重叠群。并利用末端序列引物分析同交群体,获得一对新的STS标记HY27,并将其整合到遗传图谱上,与恢复基因的遗传距离为2.1cM。STS679标记所筛选的阳性BAC克隆HZ-55-E7测序,序列分析表明该克隆上包含有7个基因分别为未知基因、反转座子基因和5个多聚半乳糖醛酸酶基因。核酸序列和氨基酸序列分析表明5个多聚半乳糖醛酸酶基因由序列相同的3个GhPG2和2个GhPG3基因组成。蛋白结构域分析表明GhPG2和GhPG3基因都属于糖苷水解酶第28类蛋白家族（Glycosyl hydrolases family）。信号肽预测分析GhPG2蛋白第24和25个氨基酸残基处（G-Q）有一个信号肽识别位点。而GhPG3基因没有预测到任何信号肽剪切识别位点。从棉花花药cDNA和抗虫棉三系基因组DNA中分别克隆到GhPG2基因的开放阅读框长度为1 239bp和相应的gDNA序列1 518bp,序列分析表明该基因包含4个外显子和3个内含子,内含子剪切位点符合GT-AG规则。比较分析棉花恢复系Y18R、保持系P30B和不育系P30A三者中GhPG2基因的基因组序列,发现三者序列一致。与其他物种PG基因的氨基酸序列比对表明该基因包含4个保守的结构域,进化树分析表明GhPG2基因归类于花粉表达的一类PG基因的分支C上。半定量RT-PCR结果表明:GhPG2基因仅在恢复系和保持系的花瓣、花药和Ⅵ级花蕾中检测到表达,不育系相对应的组织未检测到表达。实时荧光定量PCR结果表明:在恢复系和保持系花瓣、花药和Ⅵ级花蕾中GhPG2基因为高表达,其相对表达量分别为4.33和4.08倍、13.29和12.12倍、3.25和3.10倍;分别为不育系花瓣、花药和Ⅵ级花蕾表达量的1.73和1.45倍、3.7倍和3.4倍、1.63和1.39倍。保持系与恢复系之间的花药、花瓣和Ⅵ级花蕾该基因表达量差异不明显。与恢复系和保持系相比,该基因在不育系花瓣、花药和Ⅵ级花蕾中表达量明显降低。推测该基因可能为棉花花器官发育相关基因。综上所述,本文首次构建了高产抗虫三系杂交棉细胞质雄性不育恢复系Y18R的恢复基因遗传图谱。获得两个新标记MGHES28和STSHY27与恢复基因紧密连锁。两个新标记目前尚未见有报道。所构建恢复基因遗传图谱与前人所报道的在遗传距离、标记的位置存在明显差异。首次从棉花中克隆了GhPG2基因,并报道了抗虫棉三系中GhPG2基因的序列分析和各个组织中表达模式,推测该基因为棉花花器官发育相关的基因。为进一步揭示棉花细胞质雄性不育和育性恢复的机理提供了一定理论依据。建立了一种高效筛选棉花BAC文库和利用阳性BAC末端序列构建重叠群的PCR方法。利用5个分子标记筛选Y18R恢复系BAC文库,共获得21个阳性克隆。基于阳性克隆末端序列构建了2个BAC阳性克隆重叠群;为进一步通过染色体步移获得恢复基因奠定了基础。