本文包括两部分：第一部分是凋亡接头蛋白FADD在T细胞发育中的非凋亡功能研究,第二部分是转基因富铁番茄新种质的创造及其若干有益性状的鉴定。　　 ㈠凋亡接头蛋白FADD在T细胞发育中的非凋亡功能研究。FADD(Fas-associated death domam protein),是Dixit和Wallach两个研究小组利用酵母双杂交系统,在HeLa细胞、人B淋巴细胞和鼠T淋巴细胞表达文库中筛选Fas相关蛋白时发现的一种凋亡接头蛋白。FADD作为凋亡接头分子,主要在死亡受体(death receptors,DRs)介导的细胞凋亡通路中扮演信息传递者的角色。除了介导细胞凋亡外,FADD还参与其它的生物学过程,如胚胎发生、天然免疫、细胞增殖、细胞周期进程等。今天,非凋亡FADD的生物学功能研究已经成为一个新的热点。关于FADD的非凋亡功能研究主要是利用转基因小鼠在T淋巴细胞领域进行的。就构建策略来看,这些小鼠可以分为三类:FADD显性失活转基因小鼠(FADD-DN)、FADD-/-→RAG-1-/-嵌合体小鼠和T细胞特异性FADD基因敲除小鼠(Lck-FADD、Lck-FADD-EGFP和CD4-FADD-EGFP小鼠)。一个基本的共识是:FADD参与T细胞的发育,FADD缺失将抑制T细胞的增殖和分化。另一方面,其研究结果的很多方面又是相互冲突的。这种冲突集中表现在两个方面:第一,在FADD-/-→RAG-1-/-嵌合体小鼠的胸腺T细胞总量的减少(5周龄时会消失)与其外周T细胞总量的下降不成比例;第二,在Lck-FADD-EGFP小鼠和CD4-FADD-EGFP小鼠中,胸腺细胞总量正常,这与Lck-FADD小鼠的胸腺细胞总量的急剧减少和FADD-/-→RAG-1-/-嵌合体小鼠的胸腺细胞的最终消失又是明显冲突的。FADD-EGFP和FADD在本质上是不同的。EGFP引入很可能改变野生型FADD的原有结构,而这种变化又可能会掩盖野生型FADD在T细胞发育中的本质功能,这也许是上述问题产生的根源。在本研究中,我们利用loxP/Cre重组系统制备了两种T细胞特异性FADD基因敲除小鼠:CD4-FADD小鼠和Lck-FADD小鼠;然后以这两种条件性FADD基因敲除小鼠为材料,对FADD在T细胞发育中的非凋亡功能进行了较为系统地研究。主要的研究内容包括：⑴基于loxP/Cre重组系统构建的T细胞特异性FADD基因敲除小鼠的基因型鉴定具有很强的挑战性,通常求助于Southern blotting或real-time PCR的方法来进行。我们建立了一种新的基于等位基因特异性反向PCR(allele-specificinverse PCR,ASI-PCR)的鉴定方法。与前两种方法相比,ASI-PCR方法简单、高效、可操作性强。新方法的建立为研究非凋亡FADD的生物学功能提供了方法学上保障。⑵调查了FADD缺失对T细胞总量及其增殖的影响。我们的研究表明,FADD缺失不仅严重破坏外周淋巴器官中CD4或CD8单阳性T细胞的稳态,而且严重影响胸腺细胞的发育与分化。这一结果与Zhang等基于Lck-FADD-EGFP小鼠和CD4-FADD-EGFP小鼠的研究结果有着本质的不同,应该说,我们的研究结果是对Zhang等研究结果的一种纠正,同时也是对基于FADD-DN小鼠和FADD-/-→RAG-1-/-嵌合体小鼠研究结果肯定和补充。⑶分析了FADD功能缺失抑制T细胞发育与分化的可能机制。在T细胞发育的早期(DN2),FADD缺失会导致胸腺T细胞在DN3期的增殖受到破坏,这可能是Lck-FADD小鼠胸腺细胞总量急剧减少的重要原因。　　 ㈡转基因富铁番茄新种质的创造及其若干有益性状的鉴定。铁是人体必需的微量元素。铁缺乏可能会导致缺铁性贫血。铁缺乏是全世界尤其是发展中国家所面临的最主要的公共卫生问题之一。全球大约有30％人口处于铁匮乏的亚营养不良状态。我国大约有20.1％居民患有贫血病。如何解决这一世界性公共卫生问题,是摆在全人类面前的一个重大而艰巨的任务。铁蛋白是自然界中最重要的铁贮存蛋白。铁蛋白贮藏铁的能力非常强,每个铁蛋白分子能够容纳多至4500个铁原子。植物铁蛋白中的铁,生物利用效率很高,是人类饮食铁的主要来源。因此,通过基因工程途径来创造铁蛋白过量表达的遗传改良作物,提高这些作物可食部分生物有效性铁的含量,可能是解决全球性铁缺乏问题的最有效的策略之一。番茄是一种重要的蔬菜。番茄果实富含维生素C。已有的研究表明,高浓度的维生素C是铁蛋白中的铁释放的促进因子。可以想象,如果获得铁蛋白工程的番茄植株,那么番茄果实中高维生素C环境可以诱发重组的铁蛋白释放更多的铁,因而可以有效提高番茄果实中的铁含量。我们的目标是,克隆植物铁蛋白基因,构建表达铁蛋白的番茄工程植株,筛选番茄果实铁含量高的株系,为番茄果实的铁营养改良创造新种质。围绕这一目标,我们开展了以下研究工作：⑴从大豆幼苗中克隆了一个新的大豆种子铁蛋白基因SferH-5(GenBank登陆号:EF055891)。与原先报道的SferH-1相比,推演的氨基酸序列之间有10个氨基酸残基的不同,其中5个分布在非成熟区,5个分布在成熟区。分布在成熟区的5个残基没有涉及到与铁吸收和铁贮藏相关的保守残基。推测,SferH-5编码一个新的大豆种子铁蛋白26.5-kDa亚基,H-5。⑵构建了预成熟H-5亚基(28 kDa,对应于H-5亚基的叶绿体前体蛋白)和大豆种子铁蛋白样H-5/H-2复合物的原核表达载体,实现了二者在大肠杆菌中的高效表达和纯化。与重组H-1亚基相比,重组H-5亚基具有更高铁(Ⅱ)吸收活性和更大的铁(Ⅲ)贮藏能力。⑶构建了P35s驱动的大豆种子SferH-5的高效植物表达载体。利用农杆菌介导的遗传转化方法,把SferH-5基因导入番茄基因组,获得了铁蛋白超量表达的转基因番茄工程植株,为番茄果实的铁营养改良培育了可稳定遗传的种质材料。与野生型番茄相比,转基因番茄叶片中铁含量提高大约3倍,果实中铁含量提高大约2倍。