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背景与目的大肠癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,严重威胁人类的生命健康。在我国,随着生活水平的提高和饮食习惯的改变,大肠癌的发病率和死亡率呈逐年上升趋势。传统大肠癌治疗中,以手术切除为主,辅以化疗和放疗。然而,仍有20%患者失去手术机会,且对化疗和放疗不敏感。寻找新的化疗药物及基因治疗为大肠癌的治疗提供了新的方向。联合治疗可能对大肠癌的治疗提供新的机遇。热休克蛋白是细胞内的分子伴侣蛋白,它们对蛋白质的折叠、装配及转运起基本管家功能。这些底物蛋白质包括:转录因子、蛋白激酶及参与调控转录、转导过程的蛋白分子如类固醇激素受体和NO合酶.所有的热休克蛋白在肿瘤细胞内是高表达的。Hsp90是真核细胞中表达最丰富的热休克蛋白,它选择性地与一些关键的信号蛋白、蛋白激酶及致瘤的信号转导蛋白作用,起调控细胞生长、增殖及凋亡的作用,而这个特性也使得Hsp90成为抗肿瘤治疗的有效靶点之一。17-烯丙胺-17-脱甲氧格尔得霉素(17-allylam io-17-desmethoxygel-danamycin,17-A A G)是geldanamycin的类似物,能够抑制Hsp90的功能,geldanamycin and 17-AAG在部分肿瘤细胞中显示出其潜在的诱导肿瘤细胞凋亡及细胞周期阻滞的功能。有研究报道17-AAG能够呈时间-剂量依赖性抑制多种肿瘤细胞的增殖,诱导肿瘤细胞凋亡,导致肿瘤细胞周期阻滞,增加肿瘤细胞对化疗药物敏感性及逆转肿瘤细胞对化疗药物的耐药性。Survivin蛋白质在2003年时被发现也是Hsp90的底物蛋白质,Hsp90通过其分子伴侣功能,对Survivin蛋白质的成熟、结构稳定及功能的发挥起到重要作用。Survivin蛋白质是凋亡抑制蛋白(IAP)家族的重要成员,能够控制细胞的有丝分裂和抑制细胞的凋亡,是目前发现的最强的凋亡抑制因子。Survivin蛋白质是体内重要的与细胞周期相关的蛋白质,表达呈周期依赖性。G0/G1期Survivin表达低,在S期及G2/M期表达高,过表达Survivin,可导致细胞向S期转换,促进细胞增殖。Survivin基因在抑制细胞凋亡,调节细胞周期,促进细胞增殖及细胞转化等方面均发挥着重要作用。在结肠癌的发生发展中,Survivin基因保护肿瘤细胞免于凋亡,促进肿瘤细胞的侵袭与转移。Survivin作为最强的凋亡抑制基因,为大肠癌的基因治疗提供了很好的作用靶点。本课题组前期实验中利用小片断RNA及短发夹RNA技术,在大肠癌LoVo细胞中沉默凋亡抑制基因Survivin,结果导致LoVo细胞阻滞于G0/G1期,凋亡细胞增加,Survivin基因表达下降抑制了LoVo细胞的增殖。本研究观察Hsp90抑制剂对大肠癌LoVo细胞生物学特性影响,观察沉默Survivin基因能否增强LoVo细胞对Hsp90抑制剂17-AAG的敏感性,并探讨其可能的机制。方法一、17-AAG对LoVo细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响及可能机制1、细胞增殖抑制率及半效抑制浓度(IC50)测定,取对数生长期的LoVo细胞,采用MTT法,应用酶标仪以550为波长,测定样品的吸光度(OD)值,并计算增殖抑制率。增殖抑制率=(1-OD药物/OD对照)×100%,半对数纸上绘制剂量效应曲线,确定IC50。根椐细胞增殖抑制率选择后续实验中的药物浓度。2、Hoechst33258染色观察凋亡细胞核形态学变化。3、Annexin V-FITC/PI双染流式细胞分析细胞凋亡率。4、PI染色流式细胞分析检测细胞周期。5、Western blot方法检测17-AAG对LoVo细胞Survivin蛋白影响。6、Caspase-3检测试剂盒检测Caspase-3活性,提取总蛋白,测定波长为405nm时的吸光光度值。二、17-AAG对沉默了Survivin基因的LoVo细胞增殖及周期的影响1、采用脂质体转染技术将前期试验构建的Survivin-shRNA-pGenesil-1质粒转染入大肠癌LoVo细胞,G418筛选,挑取单克隆细胞培养,构建稳定转染细胞株。2、Western blot方法检测稳定转染细胞株Survivin蛋白的表达3、细胞增殖抑制率及半效抑制浓度(IC50)测定,取对数生长期的LoVo细胞采用MTT法,应用酶标仪以550为波长,测定样品的吸光度(OD)值,并计算增殖抑制率。增殖抑制率=(1-OD药物/OD对照)×100%,半对数纸上绘制剂量效应曲线,确定IC50。4、流式细胞仪PI单染测凋亡周期。结果一、17-AAG呈时间-剂量-依赖性抑制LoVo细胞增殖。100ng/ml、500ng/ml及800ng/ml 17-AAG作用于LoVo细胞24h后,细胞增殖抑制率分别为(21.073±0.147)%、(40.807±0.853)%、(60.343±1.446)%,作用48h后,细胞增殖抑制率分别为(27.287±0.530)%、(48.170±0.573)%、(80.970±0.747)%,作用72h后,细胞增殖抑制率分别为(34.747±0.662)%、(67.810±0.602)%、(88.416±0.533)%。24h、48h及72h 17-AAG对LoVo细胞的IC50分别为:(823.967±48.146)ng/ml、(356.813±5.045)ng/ml、(180.245±1.468)ng/ml。17-AAG诱导LoVo细胞凋亡,100ng/ml及500ng/ml 17-AAG作用于LoVo细胞后,细胞出现明显的核固缩、核分裂及凋亡小体,药物浓度增高,凋亡核明显增多,而对照组少量细胞出现凋亡核形态改变;500ng/ml 17-AAG作用72h,细胞凋亡率为(11.800±4.547)%,100ng/ml 17-AAG及未处理组凋亡率为分别为(6.863±2.535)%及(1.873±0.687)%(P＜0.01)。100ng/ml及500ng/ml 17-AAG作用72h,G0/G1分别为(61.243±3.539)%、(74.050±3.306)%;阻滞LoVo细胞于G0/G1期,未加药处理的LoVo细胞G0/G1期比例仅为(48.237±0.895)%(P＜0.01)。500ng/ml17-AAG作用于LoVo细胞72h可以清除近40%的Hsp90底物蛋白质Survivin(P＜0.01);17-AAG作用72h后能引起caspase-3激酶活性显著增高(P＜0.01)。二、通过脂质体转染Survivin-shRNA-pGenesil-1质粒入LoVo细胞的方法,成功构建稳定干扰Survivin基因表达的LoVo细胞株,Western blot结果表明,转染株细胞的Survivin蛋白的表达明显低于未转染组;17-AAG呈时间-剂量-依赖性抑制稳定转染Survivin-shRNA-pGenesil-1质粒LoVo细胞的增殖,100ng/ml、500ng/ml及800ng/ml 17-AAG作用于LoVo细胞24h时,细胞增殖抑制率分别为:(31.826±0.283)%、(54.500±0.485)%、(76.297±0.628)%,48h时细胞增殖抑制率分别为:(39.380±0.356)%、(73.730±0.671)%、(78.433±0.569)%,72h小时,细胞增殖抑制率分别为(45.063±0.215)%、(83.110±0.276)%、(95.777±0.808)%,每次实验重复三次。根椐增殖抑制率计算17-AAG对稳定转染LoVo细胞的24h、48h及72h的IC50分别是:(314.793±2.42)ng/ml、(179.180±0.465)ng/ml、(83.497±0.505)ng/ml,分别与17-AAG对未转染LoVo细胞24h、48h、72h IC50相比,差异有显著性(P＜0.01);细胞周期结果表明,17-AAG在100nng/ml时能引起(75.880±3.157)%转染细胞处于G0/G1期,与单用药物500ng/ml时引起的G0/G1期细胞比例相当。结论17-AAG呈时间-剂量-依赖性抑制LoVo细胞增殖,通过激活Caspase-3的途径,促进细胞凋亡,能阻滞细胞周期于G0/G1期,降低Survivin蛋白的水平;对于稳定Survivin-shRNA-pGenesil-1质粒的LoVo细胞,17-AAG在更低浓度时能引起对未转染LoVo细胞高浓度作用时相同的效果,说明沉默Survivin基因可能提高人结肠癌LoVo细胞对17-AAG的敏感性。