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增生性瘢痕是皮肤损伤后组织修复过程中出现的瘢痕组织过度增生性病变,瘢痕增生挛缩影响患者的外观和功能,导致其生活质量下降。其发病机制和病因目前尚未完全阐明,仍旧是整形科基础研究的热点之一。很多实验己证明丝裂霉素C(mitomycin C,MMC)应用于瘢痕疙瘩治疗可收到良好的效果。
转化生长因子β(Transforming growth factor-β,TGF-β)是目前公认的与瘢痕疙瘩形成最为密切的细胞因子,研究表明,Smad家族作为细胞质内TGF-β下游的信号转导因子,在瘢痕疙瘩的发生发展过程中起到关键作用。但针对丝裂霉素C经由TGF-β/Smad信号通路作用于瘢痕疙瘩分子机制的报道较少。本实验应用MTT法检测MMC对体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖活性的影响,用Western blot和RT-PCR方法检测MMC作用下瘢痕疙瘩成纤维细胞中Smads蛋白和TGF-β1mRNA的表达,探讨MMC对TGF-β/Smad信号通路的作用机制,为治疗瘢痕增生提供一定的理论参考依据。
目的:
观察MMC对TGF-β/Smad信号通路的作用,探讨MMC治疗瘢痕增生的作用机制。
方法:
1:应用手术中切取的瘢痕疙瘩组织作为体外原代和传代培养瘢痕疙瘩成纤维细胞的组织来源,细胞培养成功后,取3-6代生长状态良好且处于对数生长期的细胞用于实验。
2:实验分组及干预:分为正常对照组、不同浓度MMC干预组。MMC干预组分别用2.5μg/ml、12.5μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml的MMC处理细胞。正常对照组用10%FBS的DMEM培养液培养瘢痕疙瘩成纤维细胞。
3:采用四唑盐比色(MTT)方法,观察MMC对体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖活性的影响。
4:采用RT-PCR方法,检测MMC对体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞TGF-β1mRNA表达的影响。
5:采用Western blot技术检测MMC作用下,体外培养瘢痕疙瘩成纤维细胞中Smad2/3、Smad4、Smad7蛋白的表达,观察MMC对Smad表达的影响。
6:数据处理采用SPSS13.0统计学软件进行,采用单因素方差分析和LSD-t检验,P<0.05为差异有统计学意义。
结果:
1:体外瘢痕疙瘩成纤维细胞的形态学观察
体外瘢痕疙瘩成纤维细胞原代培养成功后,培养细胞呈梭形,细胞体积较大,胞质向外伸出2-3个长短不同的伪足,有一个较大的卵圆形核,细胞界限清楚,开始单个细胞一般铺展很开,细胞间排列疏松,有较大的细胞间隙,随后细胞增多,则细胞相互平行排列,成群细胞呈漩涡状或放射行走。
2:MMC对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖活性的影响
2.5μg/ml、12.5μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml的丝裂霉素分别干预增生性瘢痕成纤维细胞24h,48h,72h,应用MTT法测定MMC对成纤维细胞生长的抑制率。2.5μg/ml~200μg/ml时,2.5μg/ml的MMC即对细胞生长有明显的抑制作用,这种抑制作用在200μg/ml时达到最大,显示出明显的剂量—效应依赖关系。在24h、48h、72h这3个时间段内,随着培养时间的增加,细胞生长抑制率呈现上升趋势,作用48h,72h,与24h相比,有极显著差异(p<0.01),作用72h与48h相比,但差异不显著。
3:不同浓度的MMC对TGF-β1 mRNA表达的影响
3.1:RNA提取后,经Bio-mini测定,A260/A280均为1.8-2.0之间;琼脂糖凝胶电泳显示所提RNA完整,降解较少。表明RNA提取成功。总RNA扩增产物电泳后背景清晰,未见电泳条带,表明无基因组DNA的污染。
3.2:TGF-β1 mRN,A RT-PCR.扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳为110bp的条带,结果与预期一致,证明所扩增产物为目的片断。
3-3:TGF-β1与β-actin扩增产物均显示为清晰的条带。计算每例TGF-β1与β-actin条带光密度的比值作为TGF-β1 mRNA相对表达量。结果显示,正常对照组,2.5μg/ml、12.5μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml的丝裂霉素干预组的TGF-β1 mRNA相对表达量分别为0.88±0.08,0.80±0.07,0.51±0.05,0.47±0.05,0.36±0.04和0.22±0.02。MMC干预组TGF-β1 mRNA相对表达量明显低于正常对照组,从12.5μg/mlMMC开始具有显著的统计学差异(P<0.01)。随MMC浓度增大,MMC干预组TGF-β1 mRNA相对表达量呈逐渐降低趋势。
4:蛋白免疫印迹检测Smad2/3、Smad4、Smad7蛋白的表达
Western-Blot检测发现:正常对照组及MMC2.5μg/ml~200μg/ml不同浓度组瘢痕疙瘩成纤维细胞中Smad2/3蛋白相对表达量分别为0.11±0.02,0.10±0.04,0.10±0.02,0.08±0.02,0.06±0.01,0.05±0.02:Smad4蛋白相对表达量分别为0.34±0.04,0.40±0.03,0.36±0.08,0.33±0.10,0.36±0.03,0.39±0.03;Smad7蛋白相对表达量分别为0.04±0.01,0.06±0.02,0.10±0.03,0.18±0.08,0.21±0.10,0.36±0.17。与正常对照组相比,12.5μg/mlMMC开始对瘢痕疙瘩成纤维细胞中Smad7蛋白的表达具有明显增强效应(P<0.05),50μg/ml MMC对Smad2/3蛋白的表达开始有减弱效应(P<0.05),而对Smad4蛋白的表达无明显变化。
结论:
1:2.5-200μg/ml范围的MMC可有效抑制体外培养的病理性瘢痕成纤维细胞的增殖活性,当浓度为200μg/ml时作用尤为明显。
2: MMC对TGF-β1mRNA的表达具有明显减弱效应;加入不同浓度的MMC能明显增加瘢痕疙瘩成纤维细胞中Smad7蛋白的表达,减弱瘢痕疙瘩成纤维细胞中Smad2/3蛋白的表达,而对Smad4蛋白的表达无变化。
3:本研究结果提示,MMC抑制瘢痕疙瘩形成的作用机制可能为:一方面通过抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖,另一方面,通过作用于TGF-β/Smad通路而发挥抑制瘢痕增生作用。