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二十八烷醇(n-octacosanol)是一种具有众多生理功能的一元高级饱和直链脂肪醇(CH3(CH2)26CH2OH),主要以蜡酯形式存在于米糠、甘蔗等天然植物中。由于我国稻谷产量丰富,因此研究从米糠中提取的活性成分二十八烷醇的生理功能及分子机制,对稻谷和其副产物的开发利用具有重要的实际与经济意义。二十八烷醇化学性质稳定且几乎无毒性。研究表明二十八烷醇具有促进新陈代谢,抗疲劳,保护心血管等多种生理功能。近年研究发现二十八烷醇还表现出抗炎活性,其抗炎功能分子机制尚不明确。本文利用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导RAW264.7细胞炎症模型,以及葡聚糖硫酸钠(sodium dextran sulfate,DSS)诱导小鼠溃疡性结肠炎症模型,来探究二十八烷醇抗炎功效及其分子机理。二十八烷醇对结肠炎症小鼠宏观表型、组织损伤的影响。本文利用3.0%DSS水溶液,ICR小鼠连续自由饮用11 d,建立结肠炎症模型。饮用DSS水溶液之前,保护组小鼠提前2天灌胃二十八烷醇混悬液(100mg/kg/day)。DSS损伤组小鼠出现体重下降、懒动、嗜睡、毛发光泽度下降及肉眼可见便血等现象,疾病活动指数(disease activity index,DAI)不断升高。其结肠组织发生溃疡、充血、水肿等症状,肠壁增厚,长度缩短,重量增加、脾脏增大。保护组小鼠精神状态有所改善,肉眼可见少量便血或无便血,DAI评分显著降低。结直肠发生溃疡、水肿程度减轻,肠壁增厚,肠重增大、长度萎缩较损伤组有所减少。制作HE染色结肠组织切片,显微镜下可观察到:与正常组相比,损伤组小鼠结肠呈现出显著的急性炎症反应症状:黏膜大面积糜烂、溃疡,腺体的隐窝结构被破坏,淋巴细胞及伴中性粒细胞等炎性细胞浸润,杯状细胞丢失;保护组小鼠只有少量出血、炎性细胞浸润,黏膜和隐窝结构相对完整,排列比较整齐。二十八烷醇对结肠炎症小鼠生化指标含量的影响。利用试剂盒,检测小鼠结肠组织中MPCO、MDA和炎症介质NO的含量。测得损伤组小鼠结肠组织中MPO、MDA和NO含量分别升高为对照组的2.9倍、3.1倍与3.8倍,差异显著;与损伤组对比,二十八烷醇保护组小鼠结肠组织中MPO、MDA和NO含量分别降低为其0.65、0.59和0.65倍,差异显著。二十八烷醇对结肠炎症小鼠炎症因子表达的影响。分别利用实时荧光定量real-time PCR和Western blot技术检测结肠组织肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)和诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)的表达量。与对照组相比,损伤组小鼠结肠组织中四种炎症因子mRNA表达量分别升高7.51、6.16、12.95和16.54倍,差异显著;而与损伤组比较,二十八烷醇组小鼠中四种mRNA表达量分别降低为其0.61、0.45、0.25和0.61倍,差异显著。损伤组小鼠结肠组织中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和iNOS的蛋白表达量分别升高为对照组的4.44、2.73、4.54和5.00倍。而二十八烷醇保护组四种蛋白分别降低为损伤组的0.75、0.63、0.78和0.80倍,差异显著。二十八烷醇可使小鼠结肠组织中炎症因子表达量显著减少。本实验利用1.0μg/mLLPS溶液诱导RAW264.7细胞炎症模型,设置对照,LPS诱导,LPS + 10 μg/mL、30 μg/mL和100 μg/mL二十八烷醇干预组五组细胞。二十八烷醇对LPS诱导RAW264.7细胞毒性影响。将细胞置于光学显微镜下观察,各组细胞数量排列密集,形状呈梭状,生长状态良好,细胞状态无明显差异。采用MTS法检测二十八烷醇对RAW264.7细胞毒性的影响。对照组、二十八烷醇组OD值之间无显著差异(p>0.05)。说明10～100μg/mL二十八烷醇溶液对RAW264.7细胞无毒性,对其生长、状态及活性无影响,可用于后续实验研究。二十八烷醇对LPS诱导RAW264.7细胞炎症因子表达的影响。分别采用RT-qPCR和Western blot比较各组细胞炎症基因表达差异。LPS组细胞TNF-α、IL-1β、IL-6和iNOS炎症因子mRNA表达量升高为对照组的5.66、7.59、6.78和2.62倍;与LPS组细胞表达量比较,10 μg/mL、30 μg/mL和100μg/mL三组二十八烷醇保护组细胞中四种炎症因子mRNA表达量均显著降低,且呈剂量依赖性。LPS诱导组细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6和iNOS炎症因子蛋白表达量分别为对照组细胞的4.31、4.80、6.25和4.29倍。与LPS组细胞比较,三组二十八烷醇保护组细胞中四种蛋白表达量显著降低,且呈剂量依赖性。二十八烷醇可显著降低细胞中炎症因子的表达水平。二十八烷醇对LPS诱导RAW264.7细胞中核转录因子(nuclear transcription factor-κB,NF-κB/p65)和(activator protein-1,AP-1/c-Jun)转录活性的影响。分别利用荧光素酶报告基因和Western blot技术,研究转录因子活性和其核移位作用。与对照组相比,LPS诱导组细胞AP-1与NF-κB相对荧光素酶活性(RLU)显著升高,分别为对照组细胞RLU 3.41和2.49倍;而二十八烷醇组细胞中RLU值显著减少,呈剂量依赖性。LPS组细胞细胞核中c-Jun和p65蛋白表达量分别增加2.17、1.56倍;而细胞浆中c-Jun和p65蛋白表达量分别为其0.53、0.41倍。与LPS组细胞比较,二十八烷醇组细胞中,细胞核c-Jun和p65蛋白表达量显著降低,细胞浆中两种蛋白表达量明显升高,且呈剂量依赖性。因此,二十八烷醇可显著抑制炎症细胞p65与c-Jun的核移位作用,降低AP-1、NF-κB转录活性。二十八烷醇对RAW264.7细胞中丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路关键靶分子的磷酸化作用:LPS诱导组细胞中p3 8、c-Jun氨基末端激酶(c-JunN-terminal kinase,JNK)与细胞外调节蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinases1/2,ERK1/2)磷酸化作用显著升高,分别为对照组细胞3.80、2.23和2.56倍。与LPS组细胞比较,二十八烷醇组三组细胞中p38、JNK磷酸化水平显著减少,且呈剂量依赖性。100μg/mL二十八烷醇组细胞p-ERK1/2表达显著减少。说明LPS可促进RAW264.7细胞中p38、ERK和JNK磷酸化,而二十八烷醇可显著抑制其磷酸化的激活。使用MAPK抑制剂处理RAW264.7细胞,利用Western blot及荧光素酶报告基因技术分析了各组细胞中炎症因子TNF-α、IL-1β表达量,p38、JNK及ERK1/2的磷酸化水平,以及其对转录因子活性的影响。结果显示,与LPS诱导组相比,抑制剂组细胞中TNF-α、IL-1β表达量,以及p38、JNK及ERK1/2磷酸化蛋白表达水平显著减少,AP-1、NF-κB转录因子的活性降低。在二十八烷醇与抑制剂共同作用下,炎症因子含量、MAPK磷酸化水平与转录因子活性进一步降低。说明MAPK磷酸化作用可使转录因子活性增强,炎症因子表达增多。二十八烷醇通过阻断MAPK通路,发挥抗炎功效。综上,在动物整体水平,二十八烷醇能够显著改善DSS诱导结肠炎症小鼠宏观表型,降低DAI,减轻结肠组织病理损伤;减少结肠组织中MPO、MDA和NO含量;抑制结肠组织炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和iNOS基因的过表达。细胞水平,二十八烷醇可下调LPS诱导的RAW264.7细胞炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和iNOS基因的过表达;抑制核转录因子NF-κκB和AP-1核移位作用和转录活性;减少p38,JNK及ERK1/2的磷酸化水平。另外,在二十八烷醇存在下,加入MAPK抑制剂可进一步抑制MAPK磷酸化、炎症因子表达以及AP-1、NF-κκB活性。提示二十八烷醇抗炎机理的分子机制,与通过抑制细胞MAPK信号通路,从而降低通路下游核转录因子活性,减少炎症因子的表达有关。