多杀菌素(Spinosyns)是一类由土壤放线菌刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)生产的次生代谢产物,属聚酮类大环内酯杀虫剂。Spinosyn家族化合物中丰度最高且活性最强的组分是Spinosyn A和Spinosyn D(合称Spinosad)。多杀菌素因其具有对靶标害虫的高效性和环境友好性特征而被广泛用于农作物害虫以及动物寄生虫的防治。然而,野生型刺糖多孢菌多杀菌素的生物合成能力很低,其菌种的遗传改良及其生理特性研究成为当前研究热点。提高多杀菌素生产率的遗传改良策略主要包括：提高其生物合称途径通量、增加其合成前体供给、减少其合成过程中副产物的形成以及改良菌株的其它性能。本研究采用传统诱变与基因工程手段对野生型刺糖多孢菌SP06081进行菌种改良,同时采用差异蛋白质组学方法探讨了多杀菌素产率提高的分子机理。为了改良刺糖多孢菌多杀菌素生产菌种,我们从甘氨酸添加浓度、溶菌酶作用温度、时间和浓度等方面对刺糖多孢菌SP06081原生质体制备条件进行优化,最佳的制备条件为：菌体在添加0.2%甘氨酸的TSB培养基中培养48h,0.1mg/mL溶菌酶,28℃酶解20min后,于R2YE再生培养基上再生,原生质体再生数目高达108个/mL以上；对其再生菌株的生理特性研究表明：原生质体再生菌株在形态和抗生素产量上均产生了分化,二者具有重要的相关性。在此基础上,对SP06081菌株进行原生质体紫外辐射诱变,结合原生质体再生菌株的自然分离,综合分析了突变子的生理特性,建立了层次筛选的快速筛选方法,并获得一株遗传性能稳定的高产菌株PR2；进一步对PR2菌株进行原生质体钴辐射诱变,筛选获得一株遗传性能较稳定的高产菌Coγ129,其多杀菌素产量比出发菌株SP06081提高到128.5%。为进一步探讨多杀菌素产率提高的代谢与分子机理,我们采用无标记定量的Shotgun蛋白质组学方法对刺糖多孢菌SP06081及其高产菌株PR2种子液培养第一快速增长期(RG1)菌体全蛋白进行比较蛋白质组学分析。LC-MS/MS分别从SP06081菌株和PR2菌株中鉴定到224和204个非冗余蛋白,其中,140个蛋白为两株菌所共有,12个蛋白为多杀菌素生物合成直接相关蛋白。进一步对140个共有蛋白的半定量比较分析发现,约31%的蛋白其丰度变化在两株菌之间存在显著差异,这些蛋白的分子功能涉及三羧酸循环、糖酵解、生物合成过程、分解代谢过程、转录、翻译及氧化还原等；其中,与某些初生代谢中间体(也是多杀菌素生产所需要的前体)合成、能量代谢、脱氧糖甲基化及抗氧化压力相关的几个关键酶在PR2菌株内均朝向促进多杀菌素生物合成的方向差异表达。对5个选择基因的实时荧光定量RT-PCR分析结果显示其中4个基因在蛋白翻译与基因转录水平的差异表达方向一致,进一步证实了我们的蛋白质组半定量分析结果。为了改善刺糖多孢菌高密度深层培养过程中的供氧不足,我们采用重叠PCR技术将透明颤菌血红蛋白基因(vgb)开放阅读框(ORF)置于红霉素抗性基因启动子(PermE)之下,并将其克隆到整合型载体pSET152上,通过接合转移方式导入刺糖多孢菌SP06081中,将vgb定点整合到SP06081菌株染色体上,获得一株遗传性能稳定的重组刺糖多孢菌SP-VHb。PCR与Southern blotting鉴定结果确证vgb已整合到染色体上；一氧化碳结合差光谱分析表明SP-VHb菌株中表达了有活性的透明颤菌血红蛋白；摇瓶发酵结果显示,在正常溶氧与中度限氧状态下vgb基因的表达均可显著促进多杀菌素的生物合成(p<0.01)。总之,本研究为进一步合理的应用基因工程与代谢工程手段对刺糖多孢菌进行遗传改良提供了有价值的技术资料和数据。