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沙门菌（Salmonella）,一种导致食源性疾病的人畜共患病原体,同时也是引起人类三大腹泻疾病的病因之一。世界卫生组织定义沙门菌是侵入性病原体（病毒、细菌、原生动物、蠕虫和化学物质）中最能引发人类肠道或全身性疾病的31种病原体之一。但由于抗生素在畜牧及医疗中的广泛应用,细菌耐药现象越来越普遍,沙门耐药菌株也相继出现。因此,需要加强新型抗菌药物的研发来控制耐药菌。与侵染动物细胞的病毒类似,也有感染细菌的病毒—噬菌体（phage）。它在自然界中的数量众多,其数量是细菌的三倍,超过1031个。且细菌对噬菌体和抗生素的耐药机制完全不同,数亿万年的共同进化,使细菌与噬菌体相互依存,对多重耐药菌株的防控有巨大的应用潜力。此外,噬菌体裂解酶在感染末期产生,具有裂解细菌的能力,这两者都有望成为抗生素的替代品或相关辅助治疗。本研究旨在分离纯化裂解沙门菌的烈性噬菌体,并获取其裂解酶,应用裂解酶制备菌影,从活性检测到应用都为沙门菌的生物防控提供了理论和研究基础,试图开发针对沙门菌的新型抗菌制剂。1.沙门噬菌体的生物学特性及全基因组测序分析本实验将运用直接分离法从重庆市北碚污水处理厂和养殖场等采集污水、粪便和垫料等样品。以不同致病血清型的沙门菌为宿主细菌进行分离,得到阳性样品15份。利用双层平板法分离纯化直至噬菌斑单一透亮,选取裂解谱广且裂解能力强的噬菌体进行全基因组测序,并分别命名为噬菌体E1964,N1965,C19620,T1973,E2012和T2011。进一步对噬菌体的生物学特征进行分析:（1）噬菌体经纯化后,T1973的单斑直径最大,约3 mm,噬菌斑外周有比较大的晕圈,其他5种约1-2 mm,无晕圈。（2）6株噬菌体感染宿主菌的最佳感染复数（Multiplicity of Infection,MOI）都是0.01。（3）温度和pH对噬菌体的生长都有明显的影响,在pH 4.0-9.0,温度30℃-60℃都能稳定存活。（4）一步生长测定结果表明:C19620的潜伏期最短,在菌中的潜伏时间低于10 min,其余噬菌体潜伏期都在10-20min;6株噬菌体裂解期都在60 min左右,在这段时间噬菌体数量呈指数增长,之后便到达平台期;吸附率属T1973最高,达到83.17%,C19620最低1.58%;裂解量E2012最高,一个细菌能裂解出294个噬菌体。通过对这六种噬菌体测序结果的分析,对其中四种噬菌体深入研究。电镜结果显示噬菌体E1964、T1973、E2012、C19620都具有二十面体的头部和尾部,属于有尾噬菌体目,E1964、T1973、E2012属于肌尾噬菌体科;C19620属于长尾噬菌体科。经过提取与纯化,得到纯度较高的噬菌体基因组,对其进行测序。噬菌体E1964基因组长52,491 bp（GC含量46%）,E2012基因组大小为42,414 bp（GC含量50%）,C19620基因组大小为59,607 bp（GC含量56%）,T1973基因组大小为155,783 bp（GC含量45%）,N1965基因组大小为43,246 bp（GC含量50%）,T2011基因组大小为42,896 bp（GC含量50%）,都属于环状双链DNA。从系统进化树分析,N1965、E2012和T2011这三种噬菌体在进化中的亲缘性非常近,其次是T1973,差异最大的是C19620。2.噬菌体疗法体内外杀菌效果初探根据6株沙门菌噬菌体基因比对和分析,我们选取了其中4株进行体外裂解试验、安全性试验和体内保护试验,进一步评估噬菌体疗法的有效性。体外实验:噬菌体鸡尾酒疗法（E1964,T1973,C19620和E2012）与单一噬菌体的杀菌效果比对,结果显示噬菌体鸡尾酒制剂比单一噬菌体抑制沙门菌的能力更强更稳定;单株噬菌体属C19620的杀菌能力最强且单一,主要针对猪霍乱沙门菌。其次对噬菌体进行安全性评价。以噬菌体T1973为例,分别将噬菌体T1973(1010PFU/100μL)或生理盐水（100μL）口服后,两组小鼠进食量、活动量均正常。噬菌体处理后24 h、3、6、9、12、15、21、35天对小鼠实施安乐死。在每个时间点采集血液、粪便和七个器官（肝、肺、脾、肾、小肠、大肠、心脏）的样本,检测到噬菌体1-3天内在体内的滴度达到峰值,尤以肺中数量最高,之后就会递减,一周左右被体内清除,安全性较好。最后是噬菌体鸡尾酒对沙门菌感染小鼠的治疗实验。建立沙门菌重度感染模型,探讨噬菌体鸡尾酒的治疗条件和效果。在实验室之前研究的基础上,确定小鼠的最小致死剂量为10~8CFU/只,一周内全部死亡。口服沙门菌混合悬液10~8CFU/50μL:肠炎沙门菌,鼠伤寒沙门菌,猪霍乱沙门菌,以细菌最小致死量口服感染三天后,经不同途径（口服,腹腔,皮下）给予噬菌体鸡尾酒制剂(1010PFU/100μL)。结果显示,腹腔和皮下组第一天小鼠血液中的噬菌体量高达10~8PFU/mL,口服小鼠组为10~6PFU/mL,但存活率并没有得到提高,与对照组相比体内细菌的数量并没有明显的减少。和体外实验结果有很大的差距,表明噬菌体在进入沙门菌感染的小鼠体内并没有起到杀菌作用。3.裂解酶的表达和应用通过数据库比对分析,得到E1964,T1973,C19620和E2012的裂解酶基因Lys1964、Lys1973、Lys19620、Lys2012。根据四种裂解酶的特性对其采用不同的原核表达载体,进行表达和纯化,成功表达Lys1964、Lys1973、Lys2012,分别得到大小为18.0 kDa,58.7 kDa和17.3 kDa的蛋白。在鼠伤寒沙门菌内四株裂解酶有不同程度的裂解效果,其中Lys19620的活性最强。菌外试验显示,单独作用的裂解酶杀菌效果不明显,对革兰氏阴性菌来说,细菌外膜阻碍了肽聚糖和裂解酶的直接接触。因此造成部分裂解酶对革兰氏阴性菌,如大肠杆菌和沙门菌,杀菌或抑菌效果不理想。本实验筛选了8种小分子肽来克服这一困难,成功诱导表达4种抗菌肽和裂解酶串联的工程内溶素（Artilysins）,其中Lycotoxin1能增强裂解酶的杀菌作用。此外,Lys19620作为一种新型裂解酶,作用于细胞肽聚糖部位,使细胞壁破碎。可以运用其良好的裂解效果制备菌影疫苗,通过电镜结果显示能形成菌影的典型特征—孔洞。综上所述,本研究全面解析了分离得到的沙门菌噬菌体及其裂解酶,并对其应用进行了初步探究,为治疗沙门菌感染提供了不同的策略,打下了坚实的理论与实验基础。