研究目的半巢式全自动实时荧光定量PCR检测(GeneXpert MTB/RIF)采用GeneXpert MTB/RIF检测系统,是全自动半巢式实时荧光PCR体外诊断技术,可同时检测结核分枝杆菌以及利福平耐药性。近几年来,因其敏感度和特异性高且操作简便快速而得到广泛关注。2010年12月世界卫生组织(WHO)批准了全自动医用PCR分析系统(Genexpert(?)Systerm)应用于肺结核病及利福平耐药的诊断,半巢式全自动实时荧光定量PCR检测技术也被世界卫生组织(WHO)誉为结核病实验室诊断技术最重要的进步。2011年,WHO推荐使用GeneXpert MTB/RIF试验作为快速诊断活动期肺结核及利福平耐药的方法,GeneXpert MTB/RIF试验在涂阳肺结核的敏感度高于95%,涂阴肺结核的敏感度高于55%[1]。肺结核尤其是耐药肺结核是世界范围的公共卫生难题之一,其病死率已经从每年的1.6*106上升到2.2*106。快速并准确的诊断活动期肺结核能有效地阻止其在人群的流行。目前对于活动期结核病的实验室诊断方法包括痰涂片抗酸染色,结核分枝杆菌培养,和干扰素释放实验等。所有的这些实验都存在敏感度和特异性偏低,检测周期长或成本高等局限性。基于DNA扩增技术的GeneXpert MTB/RIF试验能够打破这些局限,提高结核病快速诊断的敏感度和特异性。中国耐药结核病发生率仅次于印度,在全球排名第二位,并且是世界肺结核耐药性最高的国家[2]。GeneXpert MTB/RIF试验在中国诊断结核病及利福平耐药的应用价值仍然在研究中,关于GeneXpert MTB/RIF在肺结核病诊断的作用有一定的研究,但是,全面评估应用GeneXpert MTB/RIF试验诊断肺外结核病很少报道。本研究的目的是评价GeneXpert MTB/RIF试验在肺结核及肺外结核患者直接诊断结核分枝杆菌和利福平的耐药性的应用价值。多数国内关于GeneXpert MTB/RIF在肺内及肺外结核诊断作用的评估以结核菌固体培养为标准,本研究分别以结核菌BDMGIT960快速液体培养和临床诊断为作为标准评估GeneXpert MTB/RIF试验在诊断肺内及肺外结核病的应用价值。由于利福平的耐药性低于异烟肼的耐药性,多数利福平耐药的患者同时存在异烟肼耐药,因此很多国家推荐GeneXpert MTB/RIF检测出利福平耐药的患者可以按照耐多药结核病(MDR-TB)进行治疗,本课题将纳入病例培养阳性的菌株进行MGIT960快速药物敏感性试验,药敏结果与GeneXpert MTB/RIF检测利福平耐药结果进行比对,评估GeneXpert MTB/RIF检测利福平耐药的敏感度和特异性,同时评估GeneXpert MTB/RIF试验预测MDR-TB病人的敏感度和特异性,同时对两者有差异性的样本进行焦磷酸测序,评估GeneXpert MTB/RIF检测ropB基因突变的准确性。研究方法第一部分:本研究是在山东省胸科医院开展的,是山东省唯一的一个省级防治结核病和其它肺部疾病的医院。山东省是中国第二大省份,拥有9千6百万的人口,其中59%的农村人口。山东省每年新发病例约4万。本研究收集2013年7月到2014年6月在山东省胸科医院住院治疗的共506名疑似结核病患者的标本,包括疑似肺结核患者229名(痰标本229例),疑似肺外结核患者277名(101例脑脊液标本,124例胸腔积液标本,22例组织标本,21例尿液标本和9例腹腔积液标本),每例疑似结核病患者取3份标本,一份采用荧光染色显微镜镜检;一份采用BACTECTM MGITTM 960 Mycobacterial Detection System(BD,NJ,USA)进行结核菌快速培养;一份用于GeneXpert MTB/RIF检测。GeneXpert MTB/RIF检测结果与金标准结核分枝杆菌培养结果及临床诊断分别比较,评价GeneXpert MTB/RIF对痰液样本及包括脑脊液、胸腔积液等肺外样本中检出结核分枝杆菌的敏感度和特异性。并以临床诊断为标准分别评估涂片荧光染色显微镜检测、BACTECTM MGITTM 960 Mycobacterial Detection System结核菌快速培养、GeneXpert MTB/RIF检测及三种方法联合使用诊断结核病患者的敏感度。临床诊断结核病主要通过临床症状,胸部影像学表现,阳性的实验室检查(涂片显微镜检查,结核分枝杆菌培养和GeneXpertMTB/RIF试验等)和经过抗结核试验性治疗好转作为依据[3]。第二部分:BACTECTTM MGITTM 960 Mycobacterial Detection System培养阳性的标本经涂片染色镜检确定为抗酸杆菌,使用结核分枝杆菌抗原MPT64试剂盒鉴定是否为结核分枝杆菌。经鉴定为结核分枝杆菌的样本,采用BACTECTM MGITTM 960 Mycobacterial Detection System药敏试剂盒进行药物敏感试验,主要包括2种一线抗结核药物:异烟肼、利福平。使用标准菌株H37Rv作为质控菌株进行室内质量控制。MGIT960液体药敏结果与第一部分GeneXpert MTB/RIF检测结果中利福平的药敏检测结果进行比对,评估GeneXpert MTB/RIF检测利福平耐药的敏感度和特异性,及预测MDR-TB的敏感度和特异性;对于GeneXpert MTB/RIF检测与结核分枝杆菌药敏试验(DST)检测结果有差异的样本提取DNA,应用焦磷酸测序的方法确认差异的菌株的基因型,评估GeneXpert MTB/RIF检测ropB基因突变的准确性。所有的检测都在山东省胸科医院汉光微生物实验室(通过ISO15189医学实验室认可的结核病检测实验室)内进行。结果第一部分:229名疑似肺结核患者中,GeneXpert MTB/RIF检测结果为130例(56.8%)结核分枝杆菌阳性,98例(42.8%)结核分枝杆菌阴性,还有1例不明确;结核分枝杆菌培养结果为125例(54.6%)结核分枝杆菌阳性,88例(38.4%)结核分枝杆菌培养阴性,10例(4.4%)为非结核性分枝杆菌,6例(2.6%)为标本污染;荧光染色涂片镜检结果为128例(55.9%)阳性,101例(44.1%)阴性。GeneXpertMTB/RIF试验和结核分枝杆菌培养的阳性一致率为94.3%(k = 0.885;95%CI,0.824-0.946);GeneXpert MTB/RIF试验和荧光染色涂片镜检阳性的一致率为75.1%(k = 0.751;95%CI,0.665-0.838)。有192名疑似肺结核患者临床诊断为活动期肺结核,以临床诊断为标准,GeneXpert MTB/RIF、结核分枝杆菌培养、荧光染色涂片显微镜检查及三种方法相结合的特异性均为100%,敏感度分别是67.7%(130/192)、65.1%(125/192)、61.5%(118/192)和69.8%(134/192);以BD960结核菌快速培养作为标准,GeneXpert MTB/RIF试验检测结核分枝杆菌的特异性为93.8%,敏感度为96.8%,阳性预测值(PPV)为 95.3%(89.6%-98.1%),阴性预测值(NPV)为 95.8%(88.9%-98.6%)。在277名疑似肺外结核患者当中,GeneXpert MTB/RIF检测结果为40例(14.4%)结核分枝杆菌阳性,237例(85.6%)结核分枝杆菌阴性;结核分枝杆菌培养结果50例(18.1%)结核分枝杆菌阳性,227例(81.9%)结核分枝杆菌培养阴性,未检出非结核分枝杆菌;荧光染色涂片镜检结果只有11例(4.0%)阳性,266例(96%)阴性。GeneXpert MTB/RIF试验和结核分枝杆菌培养两种方法在尿液标本中有较高的一致率(n=2;100%;K=1.0),在组织标本中阳性一致率比较低(n=11;54.6%,k =0.091)。共有210名疑似肺外结核患者被临床诊断为活动性结核病例,以临床诊断为标准,GeneXpert MTB/RIF试验、结核分枝杆菌快速培养、荧光染色涂片显微镜检查及三者相结合的方法的敏感度分别是19.0%(40/210)、23.8%(50/210)、5.2%(11/210)和34.3%(72/210)。不同种类的标本GeneXpert MTB/RIF检测的敏感度相差比较大(12.3%-61.1%),但是GeneXpertMTB/RIF试验对于肺结核和肺外结核的诊断特异性均为100%.第二部分:121例肺结核和肺外结核分离菌株进行了 DST检测。GeneXpert MTB/RIF检测出21例利福平耐药,DST检测22例利福平耐药,其中17例也存在异烟肼耐药,即多重耐药(MDR),GeneXpert MTB/RIF试验和DST检测利福平耐药的一致率是 92.6%(k = 0.746 和 95%CI,0.588-0.903)。以 DST 作为标准,GeneXpert MTB/RIF试验检测利福平耐药的敏感度为77.2%和特异性为96.0%,在预测 MDR-TB 方面敏感度为 76.5%(13/17),特异性为 96.2%(100/104)(Table 3)。GeneXpert MTB/RIF试验和结核菌药敏检测利福平耐药不一致的有9例,GeneXpert MTB/RIF试验检测利福平耐药而DST检测敏感有4例,GeneXpert MTB/RIF试验检测利福平敏感而DST检测耐药有5例,焦磷酸测序结果GeneXpert MTB/RIF试验检测利福平耐药的4例样本存在基因突变,GeneXpert MTB/RIF试验检测利福平敏感的5例样本均未检测到突变,GeneXpert MTB/RIF试验检测结果与焦磷酸测序结果一致。结论GeneXpert MTB/RIF试验对肺结核病的诊断有具有较好的敏感度和特异性,以临床诊断为标准诊断肺结核病的敏感度为67.7%,特异性为100%,以结核菌培养为标准诊断肺结核病的敏感度为96.8%,特异性93.8%,阳性预测值与阴性预测值都达到了 95%以上。对于肺结核病患者来说GeneXpert MTB/RIF试验检测时间短,操作简单,与结核菌培养的一致性高于涂片镜检,而且可以排除非结核分枝杆菌(NTM)感染,对于肺结核病的诊断具有很好的应用价值。对于肺外结核的病例研究发现,结核分枝杆菌培养的敏感度要高于GeneXpert MTB/RIF试验(23.8%vs.19%.0),远高于涂片镜检(5.29%),三种方法联合使用敏感度可达到34.3%,表明GeneXpert MTB/RIF试验单独用于诊断肺外结核病会导致检出率偏低,容易漏诊部分病人,同时进行结核菌快速培养和涂片荧光染色镜检检测,三种方法联合使用才能有效诊断肺外结核,不至于导致误诊或漏诊。不同的肺外样本GeneXpert MTB/RIF试验敏感度相差较大,对于组织样本GeneXpert MTB/RIF试验敏感度远高于其他两种方法,与其他两种方法相比GeneXpert MTB/RIF试验更适合于组织样本检测。BACTECTTM MGITTM 960 Mycobacterial Detection System 药敏实验和 GeneXpert MTB/RIF检测利福平药敏的样本共121例,其中MDR17例,占总数的14.05%,高于第五次全国流行病学调查报告报道的全国平均水平6.8%[4]。其中GeneXpert MTB/RIF检测利福平耐药的为21例,其中13例为MDR,检测为敏感的100例,其中包括4例MGITTM 960药敏检测为MDR的菌株。以MGITTM 960药敏作为金标准GeneXpert MTB/RIF检测利福平的敏感度为77.27%,特异性为95.96%,GeneXpert MTB/RIF试验检出76.5%(13/17)MDR-TB,低于部分国家学者报道GeneXpert MTB/RIF检测的敏感度。有研究报道在结核病流行的国家混合型的结核分枝杆菌感染占结核病例的50%,病人可能同时感染敏感细菌和耐药细菌,在这些病例中GeneXpert MTB/RIF试验的敏感度可能降至80%左右,这与我们的研究结果一致[9]。因此,在结核病高流行的中国GeneXpert MTB/RIF还不足以用来提示MDR-TB,需要同时进行药敏试验。