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许多细胞膜表面蛋白常常相互作用,在细胞膜表面以不同亲和力结合形成具有一定空间距离的微团簇。目前,对这些结构进行鉴定及生物学特征分析的蛋白质组学方法,主要依赖于免疫沉淀(免疫共沉淀)或/和化学交联。但是,这些方法都具有一定的缺点,比如,许多膜结合复合物蛋白相互作用的亲和力很弱,通过细胞裂解从细胞膜获取这些蛋白时,其回收率极低,甚至完全丢失。此外,通过化学交联获得的数据也较难用于蛋白质复合物混合体的分析。因此,开发适当的、灵敏的工具和技术具有重要意义。然而,适用于细胞表面低亲和力蛋白复合物的研究技术目前仍较少。 在本研究中,我们建立了一种新型蛋白质组学方法——基于酪胺的邻近位置蛋白质组学选择性标记(Selective Proteomic Proximity Labeling Assay usingTyramide,SPPLAT),用于对细胞膜表面的相互作用的蛋白质进行选择性的生物素标记,并使后续的复合物分离更适于蛋白质组学分析。其中,一个偶联过氧化物酶的抗体需要通过与目标蛋白的结合而与细胞连接。将此细胞与过氧化氢和酪胺-生物素偶联物共同孵育,产生不稳定的酪胺自由基仅共价地生物素化目标蛋白质紧邻的蛋白质上。生物素化的蛋白质通过链霉亲和素捕捉进行分离,并通过质谱方法进行鉴定。作为我们的研究模型,我们研究了鸡淋巴B细胞细胞系DT40的B细胞受体(BCR)。首先,我们分别利用NHS-LC-biotin和NHS-SS-biotin制作的酪胺标记物,对酪胺-生物素标记条件进行优化。其次,我们分别使用非标记蛋白质组学方法和细胞培养过程中对氨基酸进行稳定同位素标记(SILAC)的蛋白质组学方法,鉴定了与BCR邻近的相互作用蛋白质。其中包括了许多已报道的与BCR相关的蛋白,如整合素等与BCR信号转导和细胞黏附相关的蛋白质。同时,通过免疫荧光实验、细胞结合检测以及PLA检测,我们再次验证了一些SPPLAT方法鉴定出的蛋白质与BCR的相互作用关系。 我们的工作证明了SPPLAT是一种具有实用性的一般性研究工具,可被广泛运用于鉴定细胞膜表面相互作用的蛋白质复合物,用于了解许多未解决的细胞生物学问题。此外,SPPLAT的研究开发,在蛋白质组学、细胞生物学、生物化学和生物物理学领域均具有很强的适时性和策略相关性。