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背景缺铁性贫血在经济不发达地区的婴幼儿、育龄妇女高发,造成学习记忆能力下降,免疫功能低下等问题。中医理论认为血是记忆之本,四物汤是补血经典方剂,对缺铁性贫血幼鼠学习记忆是否有影响尚未见报道。本研究得到了重庆市基础与前沿研究计划项目(csct2014jcyj A10122)的支持。目的研究四物汤对缺铁性贫血幼鼠的体质与学习记忆能力改善作用及其作用机制,为进一步将四物汤作为用于治疗缺铁性贫血的药物提供理论依据。方法1四物汤水煎液主要成分含量的测定试验方法原子吸收法测定四物汤水煎液中的铁含量。高效液相色谱建立四物汤中阿魏酸,毛蕊花糖苷和芍药苷含量的测定方法。测定条件:色谱柱均为YMC-PACK ODS-A柱,流速均为1.0m L·min-1,柱温均为30℃。阿魏酸含量测定的流动相为乙腈:0.085%磷酸溶液=17:83,检测波长为316nm。毛蕊花糖苷含量测定的流动相为乙腈:0.1%醋酸溶液=16:84,检测波长为334nm。芍药苷含量测定的流动相为乙腈:0.1%磷酸溶液=14:86,检测波长为230nm。2缺铁性贫血幼鼠模型复制及分组给药21d大鼠,雌雄各半,分为正常组10只和造模组50只,分别饲喂含铁约45ppm的标准饲料或含铁约3ppm的低铁饲料,自由摄食饮水。2周后,各组大鼠内眦静脉采血测定血常规,以每只大鼠血红蛋白含量和体重均低于正常组大鼠均值判定为该大鼠造模成功。用随机数表法将造模成功的大鼠分为模型组,琥珀酸亚铁50mg·kg-1组,四物汤4g·kg-1组,8g·kg-1组和16g·kg-1组,每组10只。统计各造模组大鼠血红蛋白含量和体重无显著性差异后,灌胃给药,每天1次,4周后结束给药,进行下列各项试验。3四物汤水煎液对缺铁性贫血幼鼠体质的改善作用试验方法各组大鼠内眦静脉采血测定血常规,制作血涂片。肝脏行冰冻切片制作HE染色。分析比较各指标组间差异性。4四物汤水煎液对缺铁性贫血幼鼠学习记忆能力的改善作用试验方法(1)识别记忆能力测定:采用新旧物体替换法测试大鼠接触物体所占时间,共3天,大鼠对新、旧物体的探究时间分别记为Tn和Tf。大鼠接触新物体所占时间的比值=Tn/Tn+Tf。比值越大,表明大鼠的识别记忆能力越强。(2)工作记忆能力测定:采用Morris水迷宫水下平台象限法,测试大鼠找到平台的平均时间,共4天。统计各组大鼠第1,2次找到平台的平均时间差。平均时间差越大,表明大鼠的工作记忆能力越强。(3)空间记忆能力测定:第1~4天为定位航行试验。采用Morris水迷宫水下平台象限法,测得大鼠找到平台的时间为逃避潜伏期。逃避潜伏期越短,表明大鼠空间记忆获取的能力越强。第5天为空间探索试验,撤去平台,大鼠在平台所在象限游泳的时间和距离越长,表明大鼠空间记忆保持的能力越强。5四物汤水煎液改善缺铁性贫血幼鼠体质和学习记忆能力的机制试验方法取血分离血清测定血清铁、总铁结合力、血清铁蛋白和血清铁调素。肝组织匀浆测定肝脏铁和肝脏铁调素含量、肝脏铁蛋白、转铁蛋白和转铁蛋白受体1的表达。脑组织行冰冻切片制作HE染色。分离海马区,采用免疫印迹法检测突触可塑性相关蛋白BDNF,Trk B,Cam KⅡα和CREB-1的表达。结果1试验用四物汤水煎液的3种主要成分含量和Fe含量本试验四物汤水煎液中阿魏酸含量为0.374 mg·g-1,毛蕊花糖苷含量为0.040 mg·g-1,芍药苷含量为5.837mg·g-1,Fe含量为0.359 mg·g-1。2缺铁性贫血幼鼠模型成功率及用药前组间均衡性检验与正常组相比,50只造模大鼠血红蛋白含量和体重每只均显著低于正常组大鼠均值,造模成功率100%。将造模成功大鼠随机分组后,各造模组大鼠血红蛋白含量和体重均无显著性差异(均P>0.05)。3四物汤水煎液显著改善缺铁性贫血幼鼠的体质与正常组相比,模型组大鼠活动量减少,耳廓和脚趾呈苍白色;体重和各血常规参数显著降低(均P<0.05);红细胞数量减少,体积变小,中央淡染区扩大;肝脏呈浅红色,中央静脉周围的肝细胞索分界不清晰,排列杂乱。与模型组相比,四物汤组大鼠活动量增多,耳廓和脚趾色泽红润;体重和血常规各参数显著升高(均P<0.05);红细胞数量增多,体积变大,中央淡染区缩小;肝脏颜色变红,中央静脉周围的肝细胞索分界较清晰,排列趋于整齐。4四物汤水煎液显著改善缺铁性贫血幼鼠的学习记忆能力(1)与正常组相比,模型组大鼠接触新物体所占时间显著缩短(P<0.05)。与模型组相比,四物汤各组大鼠接触新物体所占时间均显著延长(P<0.05)。表明四物汤可以显著改善缺铁性贫血幼鼠的识别记忆。(2)与正常组相比,模型组大鼠第1,2次找到平台的平均时间差显著缩短(P<0.01)。与模型组相比,四物汤16g·kg-1组大鼠第1,2次找到平台的平均时间差显著延长(P<0.05)。表明四物汤可以显著改善缺铁性贫血幼鼠的工作记忆。(3)定位航行试验中,与正常组相比,模型组大鼠第2天的逃避潜伏期显著延长(P<0.01)。与模型组相比,四物汤8g·kg-1和16g·kg-1组大鼠第2天的逃避潜伏期显著缩短(P<0.05)。表明四物汤可以显著提高缺铁性贫血幼鼠的空间记忆获取能力。(4)空间探索试验中,与正常组相比,模型组大鼠在平台所在象限游泳的时间和距离显著缩短(P<0.05)。与模型组相比,四物汤各组大鼠在平台所在象限游泳的时间均显著延长(P<0.05),四物汤8g·kg-1和16g·kg-1组大鼠在平台所在象限游泳的距离显著延长(P<0.05)。表明四物汤可以显著提高缺铁性贫血幼鼠的空间记忆保持能力。5四物汤水煎液改善缺铁性贫血幼鼠体质和学习记忆能力的机制(1)四物汤水煎液改善缺铁性贫血幼鼠体质的机制:与正常组相比,模型组大鼠血清铁、血清铁蛋白、肝脏铁含量和肝脏铁蛋白表达显著降低(均P<0.05);总铁结合力、血清铁调素、肝脏铁调素、转铁蛋白和转铁蛋白受体1表达显著升高(均P<0.05);与模型组相比,四物汤组血清铁、血清铁蛋白、肝脏铁含量和肝脏铁蛋白表达显著升高(均P<0.05);总铁结合力、血清铁调素、肝脏铁调素、转铁蛋白和转铁蛋白受体1表达显著降低(均P<0.05)。(2)四物汤水煎液改善缺铁性贫血幼鼠学习记忆能力的机制:与正常组相比,模型组大鼠海马CA1区的锥体细胞排列紊乱,海马区BDNF、Trk B、Cam KⅡα和CREB-1表达显著降低(均P<0.01)。与模型组相比,四物汤各组大鼠海马CA1区的锥体细胞排列趋于整齐,海马区BDNF、Trk B、Cam KⅡα和CREB-1表达均显著升高(均P<0.05)。结论1本试验对所用四物汤水煎液进行了质量控制,其中阿魏酸含量为0.374 mg·g-1,毛蕊花糖苷含量为0.040 mg·g-1,芍药苷含量为5.837 mg·g-1,Fe含量为0.359 m g·g-1。2四物汤可以显著改善缺铁性贫血幼鼠的体质。其机制与升高血清铁、血清铁蛋白、肝脏铁含量,促进肝脏铁蛋白表达,降低总铁结合力、血清铁调素含量,抑制肝脏铁调素、转铁蛋白和转铁蛋白受体1的表达,调节铁代谢有关。3四物汤可以显著提高缺铁性贫血幼鼠的识别记忆、工作记忆和空间记忆能力。其机制可能与上调海马区BDNF及BDNF-Trk B-CREB通路蛋白的表达有关。